达沙替尼与树突状细胞疫苗在小鼠模型中对转移性乳腺癌的协同抗肿瘤效应

Synergistic anti-tumor effects of dasatinib and dendritic cell vaccine on metastatic breast cancer in a mouse model.

作者信息Ningning Song, Hulin Guo, Jia Ren, Suhong Hao, Xinchao Wang
PMID29731862
发布时间2018-05
DOI10.3892/ol.2018.8188

实验完整度

包含体外细胞培养、体内4T1移植瘤模型、组织学分析、免疫组化、TUNEL凋亡检测、存活分析及免疫细胞浸润评估等多层级验证,证据强度高。

主要模型

4T1乳腺癌细胞系 BALB/c小鼠4T1原位移植瘤模型

重点核对

4T1细胞接种数量:1×10^6 达沙替尼给药剂量:15 mg/kg DC疫苗注射次数和剂量:1×10^6细胞,在第10天和第17天 肿瘤体积测量频率:每隔一天 实验终点:第34天

摘要

免疫治疗目前被认为是主要的抗肿瘤方式之一,但其疗效有限。达沙替尼可改善CD8+T细胞和自然杀伤(NK)细胞向肿瘤微环境的扩增和募集。本研究旨在评估达沙替尼与树突状细胞(DC)疫苗在转移性乳腺癌中的协同抗肿瘤效应。将达沙替尼与DC疫苗给予接种4T1乳腺癌细胞的小鼠。此后,每隔一天测量肿瘤体积。在第34天,用体视显微镜评估肺转移。通过免疫组织化学测定肿瘤增殖和血管生成。通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记评估肿瘤组织中的细胞凋亡。结果显示,虽然未治疗对照组、DC疫苗组和达沙替尼组之间的肿瘤体积没有显著差异,但联合治疗组的肿瘤体积与其他三组相比显著减少。联合治疗组小鼠的生存时间最长,而任一单一治疗组小鼠的生存时间均略长于未治疗对照组。此外,与达沙替尼单药组、DC疫苗单药组和未治疗对照组相比,联合治疗组的肺转移结节数量显著减少。此外,与其他三组相比,联合治疗组的瘤内微血管密度显著降低。另外,联合治疗组中CD8+T细胞和NK细胞的比例较其他三组显著增加。这些结果表明达沙替尼联合DC疫苗可能是治疗转移性乳腺癌的一种可行方式。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
达沙替尼联合DC疫苗对转移性乳腺癌是否具有协同抗肿瘤效应?
核心机制
达沙替尼增强CD8+T细胞和NK细胞的扩增,与DC疫苗协同增强抗肿瘤免疫应答。
主要证据
在4T1乳腺癌小鼠模型中,联合治疗显著减小肿瘤体积、减少肺转移结节、降低微血管密度,并增加CD8+T细胞和NK细胞比例。
研究意义
达沙替尼联合DC疫苗可能成为治疗转移性乳腺癌的有效方式,但需进一步研究。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立4T1乳腺癌小鼠模型

模拟人类IV期乳腺癌,为评估联合治疗提供体内模型。

将4T1细胞皮下注射到BALB/c小鼠右侧乳腺,建立原位移植瘤模型。

2

4T1细胞裂解物制备

制备肿瘤抗原用于脉冲DC疫苗。

通过5次冻融循环裂解4T1细胞,离心去除细胞碎片,收集裂解物。

3

制备肿瘤裂解物脉冲的DC疫苗

生成负载肿瘤抗原的DC疫苗以诱导抗肿瘤免疫。

从BALB/c小鼠骨髓中分离前体细胞,经GM-CSF和IL-4诱导分化为未成熟DC,再与4T1裂解物共孵育,并用LPS诱导成熟。

4

分组并给予治疗

比较单药与联合治疗对肿瘤生长、转移和免疫的影响。

在第10天将荷瘤小鼠随机分为4组,分别接受达沙替尼、DC疫苗、联合治疗或不予处理,并按方案给药。

5

肿瘤生长和生存监测

评估治疗对肿瘤生长和生存期的影响。

每隔一天测量肿瘤体积,记录生存期,直至第34天。

6

组织学和免疫组织化学分析

评估肿瘤增殖、血管生成及免疫细胞浸润。

对肿瘤组织进行H&E染色和免疫组化染色,检测Ki67、CD31、CD8、NKG2D的表达。

7

TUNEL凋亡检测

评估治疗对肿瘤细胞凋亡的影响。

使用TUNEL试剂盒检测肿瘤组织中的凋亡细胞。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
RPMI-1640培养基HyClone; GE Healthcare Life Sciences--
胎牛血清Tianjin Haoyang Biological Products Technology Co., Ltd.--
重组小鼠GM-CSFPeproTech--
重组小鼠IL-4PeproTech--
脂多糖Sigma-Aldrich; Merck KGaA--
达沙替尼Selleck Chemicals--
LabrasolGattefosse (Shanghai) Trading Co., Ltd.--
柠檬酸钠缓冲液----
牛血清白蛋白Boster Biological Technology--
兔抗小鼠NKG2D抗体Biossbs-0938R
兔抗小鼠CD8抗体Biossbs-10699R
兔抗小鼠KI67抗体Biossbs-23105R
兔抗小鼠CD31抗体Biossbs-20322R
亲和素-生物素-过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgGBoster Biological TechnologySA1022
原位细胞死亡检测试剂盒Roche Diagnostics--
GraphPad Prism 6.01GraphPad Software, Inc.--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
4T1细胞培养条件:RPMI-1640培养基加入10% FCS,37°C;4T1细胞来源:中国科学院上海生命科学研究院细胞库。
阅读提示:Methods, Cell culture
DC疫苗制备
骨髓细胞培养条件:2×10^6细胞/100-mm培养皿,RPMI-1640+10%FCS+20ng/ml GM-CSF+10ng/ml IL-4;4T1裂解物与DC比例1:3,孵育18h;LPS成熟刺激1-2天(1 µl/ml)。
阅读提示:Methods, Tumor lysate-pulsed DCs
动物模型与治疗
4T1细胞接种量:1×10^6;小鼠品系:BALB/c雌性6周龄;分组:4组,n=8;达沙替尼剂量:15 mg/kg,口服灌胃每日一次连续7天;DC疫苗注射剂量:1×10^6细胞,第10天和第17天;肿瘤体积测量:每隔一天。
阅读提示:Methods, Tumor model and treatment protocol
免疫组化与TUNEL
抗体孵育条件:1:200稀释,4°C过夜;TUNEL试剂盒:Roche;阳性细胞计数:Ki67、CD8、NKG2D在400×下随机5个视野;微血管密度:每肿瘤5个视野;TUNEL:随机10个视野。
阅读提示:Methods, Histology and immunohistochemistry; Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL)