建立免疫性肝纤维化模型并检测激活素和IL-17信号
建立Con A诱导的免疫性肝纤维化小鼠模型，并验证激活素和IL-17信号是否被激活。
对BALB/c小鼠每周静脉注射Con A（8 mg/kg）持续6周建立纤维化模型；通过ELISA检测血清和肝组织中激活素A、IL-17A和IL-17F的水平；通过RT-qPCR和Western blot检测肝组织ACVR2A的表达。
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腺病毒介导的激活素A受体2A敲低减轻小鼠免疫诱导的肝纤维化并抑制白细胞介素-17诱导的原代肝星状细胞活化。
Adenovirus‑mediated knockdown of activin A receptor type 2A attenuates immune‑induced hepatic fibrosis in mice and inhibits interleukin‑17‑induced activation of primary hepatic stellate cells.
实验完整度
高包含体内小鼠模型（Con A诱导的免疫性肝纤维化）和体外原代mHSC实验两个独立证据层级，并进行了功能验证（肝损伤和纤维化指标）和机制验证（Smad2磷酸化）。
主要模型
BALB/c小鼠Con A诱导的免疫性肝纤维化模型 原代小鼠肝星状细胞(mHSC)
重点核对
Con A剂量：8 mg/kg/周，尾静脉注射，持续6周 Ad-ACVR2A shRNA或Ad-NC shRNA剂量：1×10^9 PFU，于第1周和第4周Con A注射后24小时尾静脉注射 mHSC刺激：重组鼠IL-17A或IL-17F，30 ng/ml，处理48小时 mHSC感染：Ad-ACVR2A shRNA或Ad-NC shRNA，MOI=50，感染24小时 统计方法：两组间使用Mann-Whitney检验或Student's t检验，多组使用单因素方差分析和Bonferroni事后检验，P<0.05为显著
摘要
纤维化导致肝功能进行性丧失，从而导致器官衰竭。激活素是转化生长因子(TGF)-β超家族的分泌蛋白，其通过与其两个II型受体结合启动信号传导：激活素A受体2A(ACVR2A)和激活素A受体2B。先前探讨免疫诱导肝纤维化机制的研究主要集中于TGF-β信号传导，而非激活素信号。为了研究激活素通路在该疾病中的作用，将含有靶向ACVR2A mRNA的短发夹(sh)RNA的腺病毒颗粒(Ad-ACVR2A shRNA)施用于长期用刀豆蛋白A(Con A)处理的小鼠。通过苏木精/伊红染色、Masson三色染色和免疫组织化学测定评估肝脏的病理变化。结果检测到Con A处理动物血清激活素A和肝脏ACVR2A水平升高。相反，当激活素信号被阻断时，肝功能部分恢复，纤维化损伤减弱。此外，Ad-ACVR2A shRNA抑制了Con A诱导的肝星状细胞(HSC)活化，表现为α-平滑肌肌动蛋白、I型和IV型胶原蛋白表达减少。此外，原代小鼠HSC(mHSC)在暴露于白细胞介素(IL)-17A或IL-17F时被活化，这些是CD4+辅助性T细胞17产生的两种主要细胞因子。用ELISA试剂盒测定激活素A、I型和IV型胶原的水平，用western blot分析测定纤维化分子的表达。相反，阻断激活素/ACVR2A削弱了HSC响应IL-17产生胶原的能力。此外，当激活素A/ACVR2A信号被抑制时，由Con A在肝脏中或IL-17在mHSC中诱导的Smad2 C末端Ser465和Ser467磷酸化部分被抑制。总之，本研究证明了激活的激活素A/ACVR2A/Smad2信号传导参与免疫诱导的肝纤维化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 激活素信号通路在免疫诱导的肝纤维化中是否发挥作用，以及其是否介导IL-17诱导的肝星状细胞活化。
- 核心机制
- 激活素A/ACVR2A/Smad2信号通路介导免疫诱导的肝纤维化和IL-17诱导的HSC活化，阻断该通路可抑制纤维化。
- 主要证据
- Con A处理小鼠肝脏和血清中激活素A和ACVR2A表达升高；Ad-ACVR2A shRNA敲低ACVR2A改善肝功能和纤维化；IL-17刺激mHSC上调激活素A和α-SMA，敲低ACVR2A抑制胶原产生和Smad2磷酸化。
- 研究意义
- 本研究揭示了激活素A/ACVR2A/Smad2通路在免疫性肝纤维化中的致病作用，为理解激活素信号在免疫细胞与HSC相互作用中的角色提供了基础，可能为肝纤维化治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
腺病毒敲低ACVR2A并评估对肝纤维化的影响
验证敲低ACVR2A是否能改善Con A诱导的肝纤维化和肝功能。
在Con A模型小鼠中，于第1周和第4周注射Ad-ACVR2A shRNA或Ad-NC shRNA；通过生化检测评估血清ALT和AST活性；通过H&E染色观察肝组织病理；通过Masson三色染色和羟脯氨酸含量评估胶原沉积。
体内验证敲低ACVR2A抑制HSC活化
评估敲低ACVR2A对Con A诱导的HSC活化的影响。
通过RT-qPCR检测肝组织中ACTA2、COL1A1和COL4A1 mRNA表达；通过Western blot和IHC检测α-SMA、胶原I和IV蛋白表达；通过Western blot检测Smad2磷酸化水平。
体外验证IL-17诱导mHSC活化及激活素信号作用
验证IL-17A和IL-17F是否能直接激活mHSC，并确定敲低ACVR2A是否抑制该效应。
原代mHSC用重组IL-17A或IL-17F（10、30、100 ng/ml）刺激不同时间（1-48h）；检测细胞上清液激活素A和胶原I/IV水平（ELISA），以及α-SMA表达（Western blot）；用Ad-ACVR2A shRNA或Ad-NC shRNA感染mHSC后，再以IL-17A或IL-17F（30 ng/ml）刺激，检测胶原产生和α-SMA、p-Smad2表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 胎牛血清 | HyClone; GE Healthcare | -- | |
| 细胞分离 | 链霉蛋白酶 | Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. | -- |
| IV型胶原酶 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| Percoll溶液 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| 细胞刺激 | 重组小鼠IL-17A | PeproTech, Inc. | -- |
| 重组小鼠IL-17F | PeproTech, Inc. | -- | |
| 动物实验 | 刀豆蛋白A | Sigma-Aldrich; Merck KGaA | -- |
| 腺病毒转染 | Ad-ACVR2A shRNA | Shanghai GenePharma Co., Ltd. | -- |
| Ad-NC shRNA | Shanghai GenePharma Co., Ltd. | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Beyotime Institute of Biotechnology | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | P0009 | |
| ACVR2A抗体 | Abcam | ab135634 | |
| 胶原I抗体 | Wuhan Boster Biological Technology, Ltd. | BA0325 | |
| 胶原IV抗体 | Wuhan Boster Biological Technology, Ltd. | BA2174 | |
| Smad2抗体 | BIOSS | bs-0718R | |
| p-Smad2S465/467抗体 | BIOSS | bs-3419R | |
| α-SMA抗体 | Wuhan Boster Biological Technology, Ltd. | BM0002 | |
| β-actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-47778 | |
| HRP标记二抗 | Beyotime Institute of Biotechnology | A0216 or A02087 | |
| 增强化学发光试剂 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- | |
| 组织学 | 伊红 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | -- |
| 酸性品红/丽春红 | -- | -- | |
| 苯胺蓝 | -- | -- | |
| 羟脯氨酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A030-1 | |
| 免疫组化 | 柠檬酸盐缓冲液 | -- | -- |
| 山羊血清 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | SL2-10 | |
| 生物素标记的山羊抗兔IgG | Beyotime Institute of Biotechnology | A0277 | |
| DAB显色液 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒 | BioTeke Corporation | RP1201 |
| Super M-MLV逆转录酶 | BioTeke Corporation | PR6502 | |
| SYBR-Green预混液 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | SY1020 | |
| Exicycler™ 96实时定量热循环仪 | Bioneer Corporation | -- | |
| ELISA | 激活素A ELISA试剂盒 | Boster | EK0302 |
| IL-17A ELISA试剂盒 | Boster | EK0431 | |
| IL-17F ELISA试剂盒 | Boster | EK0796 | |
| 胶原I ELISA试剂盒 | Uscn Life Sciences, Inc. | SEA571Mu | |
| 胶原IV ELISA试剂盒 | Uscn Life Sciences, Inc. | SEA180Mu | |
| 肝功能检测 | ALT检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C010-1 |
| AST检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C009-1 | |
| 显微镜 | BX53显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | Con A给药剂量（8 mg/kg/周）和频率（每周一次，共6周）；小鼠品系（BALB/c）、年龄（8-10周）和体重（20-23 g）。 阅读提示：Materials and methods - Animal model |
| 病毒注射 | Ad-ACVR2A shRNA或Ad-NC shRNA的剂量（1×10^9 PFU）和注射时间（第1周和第4周，Con A注射后24小时）；注射途径（尾静脉）。 阅读提示：Materials and methods - Animal model |
| 原代mHSC分离与培养 | 肝灌注和消化条件（pronase 1 mg/ml, collagenase IV 0.4 mg/ml, DNase I 0.2 mg/ml，37°C）；Percoll密度梯度离心条件（39.5%，430 × g，20分钟）；培养基（DMEM+10% FBS+双抗）。 阅读提示：Materials and methods - Cell culture |
| 体外感染与刺激 | 腺病毒感染MOI（50）和感染时间（24小时）；IL-17A或IL-17F刺激浓度（30 ng/ml）和时长（48小时）。 阅读提示：Materials and methods - Cell culture |
| 分子检测 | Western blot抗体稀释度（如ACVR2A 1:500，α-SMA 1:400）；RT-qPCR引物序列和退火温度；ELISA试剂盒型号。 阅读提示：Materials and methods - Western blot analysis, RT-qPCR, ELISA |
| 统计分析 | 组间比较适用的检验方法（Mann-Whitney或Student's t检验用于两组；单因素方差分析和Bonferroni事后检验用于多组）；显著性水平（P<0.05）。 阅读提示：Materials and methods - Statistical analysis |