验证ACKR3激动剂对aVP诱导的血管收缩和Gαq信号的影响
确定ACKR3激活是否影响aVP介导的血管平滑肌功能。
使用压力肌动图检测CXCL11、CXCL12等对PE和aVP诱导的大鼠肠系膜动脉收缩的影响；ELISA检测hVSMC中aVP诱导的IP3产生。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
精氨酸加压素受体1A与趋化因子非典型受体3在血管平滑肌中的异源二聚体的鉴定与功能表征
Identification and functional characterization of arginine vasopressin receptor 1A : atypical chemokine receptor 3 heteromers in vascular smooth muscle.
实验完整度
高包含细胞实验（hVSMC、A7r5、HEK293T）、功能实验（压力肌动图、IP3检测）、分子互作（PLA、免疫共沉淀、BRET）及信号通路验证（β-arrestin募集），证据层级多样。
主要模型
人血管平滑肌细胞（hVSMC） 大鼠肠系膜阻力动脉 HEK293T细胞 A7r5大鼠血管平滑肌细胞系
重点核对
hVSMC中ACKR3:AVPR1A异源二聚体的存在 ACKR3激动剂（CXCL11、CXCL12）抑制aVP诱导的IP3产生和血管收缩 ACKR3敲低后aVP诱导的IP3产生被消除 aVP诱导的β-arrestin 2募集受ACKR3共表达调节 AVPR1A与ACKR3在激动剂刺激后共同内化
摘要
最近的观察表明，非典型趋化因子受体(ACKR)3和趋化因子(C-X-C基序)受体(CXCR)4通过与α1-肾上腺素能受体的异源寡聚化调节人血管平滑肌功能。在这里，我们显示ACKR3也调节精氨酸加压素受体(AVPR)1A。我们观察到ACKR3激动剂抑制人血管平滑肌细胞(hVSMCs)中精氨酸加压素(aVP)诱导的肌醇三磷酸(IP3)产生，并拮抗aVP介导的离体动脉收缩。邻近连接实验、共免疫沉淀和生物发光共振能量转移实验表明，重组和内源性ACKR3与AVPR1A在细胞表面相互作用。使用siRNA和ACKR3跨膜结构域肽类似物干扰ACKR3:AVPR1A异源二聚化，消除了aVP诱导的IP3产生。aVP刺激导致β-arrestin 2募集到AVPR1A和ACKR3。虽然ACKR3激活未能将β-arrestin 2交叉募集到AVPR1A，但ACKR3的存在降低了aVP诱导的β-arrestin 2募集到AVPR1A的效率。在hVSMC中，AVPR1A和ACKR3在激动剂刺激后共同内化。这些数据表明，AVPR1A:ACKR3异源二聚体在hVSMC中组成型表达，为异源二聚体受体复合物处的分子事件提供了见解，并为先天免疫和血管活性神经激素系统之间的相互作用提供了机制基础。我们的发现表明，ACKR3是血管平滑肌功能的调节因子，并且可能是与血管反应性受损相关疾病的药物靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ACKR3是否通过与AVPR1A形成异源二聚体来调节血管平滑肌中aVP介导的信号和功能？
- 核心机制
- ACKR3与AVPR1A组成型异源二聚化，促进AVPR1A介导的Gαq信号，同时限制aVP诱导的β-arrestin 2募集；ACKR3激动剂激活后抑制AVPR1A信号和血管收缩。
- 主要证据
- 在hVSMC中通过PLA、共免疫沉淀和BRET证实了ACKR3:AVPR1A异源二聚体的存在；siRNA敲低ACKR3或TM肽干扰异源二聚化消除了aVP诱导的IP3产生；压力肌动图显示ACKR3激动剂拮抗aVP诱导的血管收缩。
- 研究意义
- 研究表明ACKR3是血管平滑肌功能的调节因子，可能成为与血管反应性受损相关疾病（如脓毒症休克）的药物靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测重组和内生AVPR1A与ACKR3的异源二聚化
验证AVPR1A和ACKR3是否形成异源二聚体。
在HEK293T细胞中共表达FLAG-ACKR3和HA-AVPR1A，进行PLA、共免疫沉淀和BRET实验；在hVSMC中进行PLA和共免疫沉淀检测内生受体相互作用。
评估ACKR3敲低对异源二聚化和aVP信号的影响
确定ACKR3在AVPR1A信号传导中的作用。
使用siRNA敲低hVSMC和A7r5细胞中ACKR3或CXCR4，通过PLA检测受体相互作用，并测量aVP诱导的IP3产生。
使用TM肽类似物干扰异源二聚化并检测功能影响
验证异源二聚化对AVPR1A信号传导的必需性。
hVSMC与TM2、TM4、TM7肽类似物孵育，检测PLA信号和aVP诱导的IP3产生以及β-arrestin 2募集。
分析异源二聚体对β-arrestin 2募集的影响
确定异源二聚化如何调节β-arrestin 2募集到各受体。
在HTLA细胞中共表达AVPR1A-Tango和ACKR3，或ACKR3-Tango和AVPR1A，检测aVP、CXCL11和CXCL12诱导的β-arrestin 2募集。
检测配体诱导的受体共同内化
验证AVPR1A和ACKR3在激动剂刺激后是否共同内化。
用aVP或CXCL11刺激hVSMC不同时间，通过流式细胞术检测AVPR1A和ACKR3的细胞表面表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因沉默
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 血管收缩功能检测 | DMT 110P压力肌动图系统 | DMT-USA | -- |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| IP3检测 | IP3 ELISA试剂盒 | LS Bio | F10644 |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoScientific | -- |
| β-arrestin募集检测 | Bright-Glo荧光素酶检测试剂 | Promega | -- |
| BRET | 腔肠素H | Nanolight Technology | -- |
| 流式细胞术 | BD FACS Canto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 压力肌动图 | 精氨酸加压素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞处理 | 泛素 | R&D Systems | -- |
| CXCL11 | Protein Foundry | -- | |
| CXCL12 | Protein Foundry | -- | |
| TC14012 | Tocris Biosciences | -- | |
| 抗体 | 抗HA抗体 | AbCam | Ab9110 |
| 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗AVPR1A抗体 | Bioss | BS-11598R | |
| 抗ACKR3抗体 | R&D | MAB42273 | |
| 抗CXCR4抗体 | AbCam | Ab1670 | |
| 抗pMLC2抗体 | Cell Signaling Technology | 3675 | |
| 流式细胞术 | Alexa Fluor 647标记抗FLAG抗体 | R&D Systems | IC8529R |
| 驴抗兔Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31573 | |
| 驴抗小鼠Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21202 | |
| 免疫共沉淀 | Pierce共免疫沉淀试剂盒 | ThermoScientific | 26149 |
| 蛋白定量 | Bio-Rad DC蛋白测定试剂盒 | Bio-Rad | 500-0116 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 压力肌动图 | 大鼠品系（Sprague-Dawley）、动脉类型（第三或第四级肠系膜动脉）、压力（80 mmHg）、预收缩剂浓度（PE 2 µM或aVP 0.5 nM）、配体浓度（10 µM） 阅读提示：材料与方法中的压力肌动图部分；图1图例 |
| 细胞培养 | hVSMC（ATCC PCS-100-012）、A7r5（ATCC-CRL-1444）、HEK293T（ATCC-CRL-11268）的培养条件、培养基、传代次数（hVSMC 2-5代） 阅读提示：材料与方法中的细胞部分 |
| PLA实验 | 细胞固定（4% PFA，15分钟）、封闭（3% BSA，4°C过夜）、一抗浓度（1:500）、孵育（37°C，105分钟）、PLA探针稀释（1:5）、连接/扩增时间 阅读提示：材料与方法中的邻近连接实验部分 |
| siRNA敲低 | siRNA浓度（1 µM）、处理时间（72小时）、对照（非靶向siRNA） 阅读提示：材料与方法中的基因沉默部分 |
| IP3检测 | hVSMC预处理（配体1 µM，15分钟）、aVP刺激（1 µM，5分钟）、细胞裂解方法、样品稀释（1:5和1:10） 阅读提示：材料与方法中的IP3 ELISA部分；图1f图例 |
| PRESTO-Tango实验 | HTLA细胞种植密度（2.5×10^5/孔六孔板）、转染DNA量（1.5 µg）、配体处理（过夜）、检测试剂（Bright-Glo） 阅读提示：材料与方法中的PRESTO-Tango部分 |
| BRET实验 | 转染量（AVPR1A-hRluc 50 ng，EYFP或ACKR3-EYFP不同比例）、供体:受体比例（1:10）、腔肠素H浓度（5 µM） 阅读提示：材料与方法中的BRET部分 |
| 流式细胞术检测受体内化 | hVSMC刺激（1 µM aVP或CXCL11，0-60分钟）、染色抗体浓度（1:200，1小时，冰上）、数据记录（至少3×10^4细胞） 阅读提示：材料与方法中的受体内化实验部分 |