检测miR-26a/b及其宿主基因在泌乳周期中的表达
探究miR-26a/b及其宿主基因在山羊乳腺组织泌乳过程中的表达动态及其与泌乳的相关性。
收集不同泌乳阶段（早期、高峰期、中期、干奶期）山羊乳腺组织，提取总RNA，通过RT-PCR检测miR-26a/b和CTDSP1/2/L的表达。
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MicroRNA-26a/b及其宿主基因通过靶向INSIG1基因协同调节甘油三酯合成
MicroRNA-26a/b and their host genes synergistically regulate triacylglycerol synthesis by targeting the INSIG1 gene.
实验完整度
高包含体外细胞模型（GMEC）的功能获得与缺失实验、荧光素酶报告基因验证直接靶标、定量PCR和蛋白印迹检测表达、脂肪酸组成分析及体内组织表达相关性分析。
主要模型
山羊原代乳腺上皮细胞（GMEC） 泌乳期山羊乳腺组织样本
重点核对
miR-26a/b mimic和inhibitor的浓度（60 nM终浓度，共转染120 nM）及转染时间（48小时） siRNA介导的CTDSP1/2/L敲低浓度（60 nM） LXRA激动剂T0901317处理浓度（1 μM） 荧光素酶报告基因载体构建（INSIG1 3'UTR全长388 bp片段，含miR-26家族结合位点及突变体） 油红O染色、TAG含量测定、脂肪酸组分分析（GC-MS）
摘要
microRNA-26（miR-26）家族已知在非反刍动物中控制脂肪生成。miR-26a和miR-26b的基因组位点定位于编码C末端结构域RNA聚合酶II多肽A小磷酸酶（CTDSP）家族蛋白的基因的内含子中。胰岛素诱导基因1（INSIG1）编码的蛋白在啮齿动物肝脏脂肪生成调节中起关键作用。在本研究中，我们研究了miR-26家族及其宿主基因在山羊乳腺上皮细胞（GMEC）中的协同功能。miR-26a/b及其宿主基因的下调降低了与脂肪酸合成相关的基因（PPARG、LXRA、SREBF1、FASN、ACACA、GPAM、LPIN1、DGAT1和SCD1）的表达、甘油三酯积累和单不饱和脂肪酸合成。荧光素酶报告基因实验证实INSIG1是miR-26a/b的直接靶标。此外，抑制CTDSP家族也下调了INSIG1的表达。综上所述，我们的发现强调了miR-26a/b、其宿主基因和INSIG1之间的功能关联，并为调控GMEC中乳脂合成的调控网络提供了新的见解。数据表明，通过营养手段靶向这一网络可能对调节反刍动物乳脂合成具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miR-26a/b及其宿主基因CTDSP1/2/L在山羊乳腺上皮细胞中是否协同调控甘油三酯合成及其机制。
- 核心机制
- miR-26a/b通过直接靶向INSIG1的3'UTR抑制其表达，进而解除INSIG1对SREBF1的抑制作用，促进脂质合成相关基因的表达；其宿主基因CTDSP1/2/L也参与调控INSIG1的表达，形成协同调控网络。
- 主要证据
- 在GMEC中敲低或过表达miR-26a/b及其宿主基因后，检测脂质合成相关基因表达（RT-qPCR）、脂滴形成（油红O染色）、TAG含量（试剂盒检测）和脂肪酸组成（GC-MS）；荧光素酶报告基因实验证实INSIG1为miR-26a/b的直接靶标。
- 研究意义
- 揭示了miR-26a/b、宿主基因CTDSP和INSIG1之间的功能关联，为理解山羊乳腺上皮细胞乳脂合成调控网络提供新见解，并提示通过营养手段靶向该网络可能对调节反刍动物乳脂合成具有重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析miR-26a/b及其宿主基因在泌乳中期的共表达关系
评估miR-26a/b与其宿主基因在泌乳中期乳腺组织中的表达相关性。
对24份泌乳中期山羊乳腺组织样本进行miR-26a/b和CTDSP1/2/L表达分析，进行相关性分析。
验证转录因子对miR-26家族和宿主基因表达的调控
探究PPARG、SREBF1和LXRA是否调控miR-26a/b及其宿主基因的表达。
用Ad-PPARG、Ad-SREBF1腺病毒和LXRA激动剂T0901317处理GMEC，检测miR-26a/b和CTDSP1/2/L的表达变化。
功能获得与缺失实验验证miR-26a/b及宿主基因的作用
明确miR-26a/b及其宿主基因对脂质代谢相关基因表达和TAG合成的影响。
在GMEC中转染miR-26a/b mimic或inhibitor以及siRNA（靶向CTDSP1/2/L），检测脂质合成相关基因表达、脂滴形成、TAG含量和脂肪酸组成。
验证INSIG1为miR-26a/b的直接靶基因
证实INSIG1是否为miR-26a/b的直接靶标，并验证其结合位点的功能。
构建含INSIG1 3'UTR（野生型或突变型）的荧光素酶报告载体，与miR-26a/b mimic或inhibitor共转染GMEC，检测荧光素酶活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Harbin Pharmaceutical Group | -- | |
| 胰岛素 | Sigma | -- | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 表皮生长因子1 | Invitrogen | -- | |
| 催乳素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞处理 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| T0901317 | Sigma | -- | |
| RNA分析 | PrimeScript RT试剂盒（带gDNA Eraser） | Takara | -- |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 抗INSIG1抗体 | Bioss | bs-5074R | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | CWBIO | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Tiagen | -- | |
| TAG测定 | 甘油三酯比色测定试剂盒 | Cayman chemical | -- |
| XD 811G生化分析仪 | Shanghai Odin Science & Technology Company | -- | |
| 荧光素酶报告实验 | psiCHECK-2载体 | Promega | -- |
| X-tremeGENE HP DNA转染试剂 | Roche | -- | |
| Dual-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| 脂肪酸分析 | 气相色谱-质谱联用仪（配HP-5色谱柱） | Agilent Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | GMEC分离自泌乳高峰期西农萨能奶山羊；基础培养基成分（DMEM/F12、10% FBS、胰岛素5 μg/mL、氢化可的松1 μg/mL、EGF 10 ng/mL）；泌乳培养基添加催乳素2 μg/mL；转染时细胞密度约80%；miRNA mimic/inhibitor和siRNA浓度60 nM（共转染时各60 nM，总浓度120 nM）；T0901317浓度为1 μM；处理时间48小时。 阅读提示：参见Materials and Methods中“Animals and cells”和“Cell treatments”部分 |
| 基因表达分析 | miRNA RT-qPCR使用S-Poly(T)法，以5S rRNA为内参；mRNA RT-qPCR使用PrimeScript RT试剂盒和SYBR Premix Ex Taq II，以三个内参基因（ubiquitously expressed transcript、mitochondrial ribosomal protein L39和ribosomal protein）的几何平均值进行标准化。 阅读提示：参见Materials and Methods中“Isolation and analysis of RNA”部分 |
| Western blot | 细胞裂解使用RIPA缓冲液加PMSF；蛋白定量使用Pierce BCA试剂盒；一抗：兔抗人INSIG1（1:500，Bioss，bs-5074R）和小鼠抗β-actin（1:1000，CWBIO）；二抗：HRP标记的羊抗兔/抗鼠IgG（1:1000，Tiagen）。 阅读提示：参见Materials and Methods中“Western blot”部分 |
| 脂滴和TAG测定 | 油红O染色：4%多聚甲醛固定1小时，5%油红O染色20分钟；TAG测定使用Cayman比色试剂盒，并按BCA法测定的总蛋白进行标准化。 阅读提示：参见Materials and Methods中“Oil Red O staining”和“Triacylglycerol assay”部分 |
| 荧光素酶报告实验 | INSIG1 3'UTR片段（388 bp，含miR-26结合位点）克隆至psiCHECK-2载体；突变体将靶位点7个核苷酸（TACTTGA）突变为TGCGGGA；共转染时每孔0.33 μg报告质粒和120 nM寡核苷酸（各60 nM）；转染后48小时测定荧光素酶活性。 阅读提示：参见Materials and Methods中“Luciferase reporter assay”部分 |
| 脂肪酸组成分析 | 约100 mg细胞用2 mL硫酸甲醇（2.5:1，v/v）进行脂肪酸甲酯化；GC-MS采用HP-5色谱柱；相对脂肪酸比例以占总峰面积的百分比计算。 阅读提示：参见Materials and Methods中“Fatty acid extraction and analysis”部分 |