构建PtenΔTKV小鼠模型
验证PDZ-BD在体内的作用
通过基因打靶删除Pten基因中编码PDZ-BD的9个核苷酸，生成PtenΔTKV小鼠，并与HPRT-Cre杂交去除neo cassette。
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Pten通过Dlg1介导的Eg5招募至中心体调控纺锤体极运动
Pten regulates spindle pole movement through Dlg1-mediated recruitment of Eg5 to centrosomes.
实验完整度
高包含体外细胞实验（MEF、HT1299、HeLa）、基因敲除小鼠模型（PtenΔTKV）、自发肿瘤和诱导肿瘤模型（Eμ-Myc、KrasLA1、DMBA），并进行功能验证和机制验证。
主要模型
PtenΔTKV/ΔTKV小鼠来源的MEF和脾细胞 Dlg1−/− MEF HT1299非小细胞肺癌细胞系 PtenΔTKV/ΔTKV小鼠自发肿瘤模型
重点核对
PtenΔTKV/ΔTKV小鼠的构建及Dlg1−/− MEF的基因型确认 Pten-Dlg1-Eg5复合物的免疫共沉淀及中心体共定位分析 Plk1、Nek9-Nek6、Cdk1对Eg5磷酸化及中心体招募的调控 PtenΔTKV/ΔTKV小鼠肿瘤发生率及与Eμ-Myc、KrasLA1、DMBA模型的肿瘤易感性
摘要
磷酸酶和张力蛋白同源物（Pten）通过其磷酸酶活性负调控PI(3)K信号，从而抑制肿瘤生长。为探究非催化性Pten结构域在正常生理过程和肿瘤发生中的作用，我们构建了缺乏PDZ结合结构域（PDZ-BD）的小鼠。在这里，我们显示PDZ-BD调控中心体运动，且其杂合或纯合缺失可促进非整倍体和肿瘤形成。我们发现Pten在Plk1依赖性方式下被招募至前中期中心体，为含有PDZ结构域蛋白Dlg1（也称为Sap97）和Eg5（也称为Kif11）的蛋白复合物（驱动蛋白，对中心体运动和双极纺锤体形成至关重要）创建了对接位点。Dlg1-Eg5复合物对Pten的对接依赖于Nek9-Nek6有丝分裂激酶级联和Cdk1对Eg5的磷酸化。PDZ-BD缺失或Dlg1消融削弱了Eg5加载到中心体和纺锤体极运动，导致易发生染色体错误分离的不对称纺锤体。总之，这些数据表明Pten通过其PDZ-BD的Dlg1结合能力，将磷酸化的Eg5积累在已复制的中心体上，以建立正确分离染色体的对称双极纺锤体，并提示该功能有助于肿瘤抑制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Pten的非催化PDZ-BD在正常生理过程和肿瘤发生中的作用是什么？
- 核心机制
- Pten通过其PDZ-BD与Dlg1结合，将Eg5（由Nek9-Nek6和Cdk1磷酸化）招募至中心体，促进纺锤体极运动，确保对称双极纺锤体形成和正确染色体分离。
- 主要证据
- 在PtenΔTKV/ΔTKV和Dlg1−/− MEF中观察到非整倍性和纺锤体不对称，中心体Eg5信号减少；免疫共沉淀显示Pten、Dlg1和Eg5形成复合物；PtenΔTKV/ΔTKV小鼠肿瘤发生率增加。
- 研究意义
- 该研究揭示了Pten PDZ-BD通过调控中心体运动和非整倍体预防来发挥肿瘤抑制活性，为理解PTEN非催化结构域在肿瘤抑制中的作用提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测染色体分离和非整倍体
评估PDZ-BD缺失对染色体分离的影响
对PtenΔTKV/ΔTKV、Pten+/ΔTKV和Dlg1−/− MEFs及脾细胞进行染色体计数、活细胞成像和FISH分析。
分析中心体运动和纺锤体结构
确定PDZ-BD缺失是否导致中心体运动缺陷和纺锤体不对称
免疫染色γ-tubulin和α-tubulin，测量前中期中心体距离和纺锤体角度，并利用活细胞成像测量中心体运动速度。
鉴定Pten-Dlg1-Eg5相互作用
验证Pten通过Dlg1招募Eg5至中心体
通过免疫沉淀和免疫共定位分析Pten、Dlg1和Eg5之间的相互作用；使用shRNA敲低PTEN、DLG1、NEK9、NEK6、CCNB1等。
验证激酶对Eg5磷酸化的调控
确定Plk1、Nek9-Nek6、Cdk1对Eg5磷酸化和中心体招募的贡献
使用Plk1抑制剂BI2536、Aurora A抑制剂MLN8054、shRNA敲低CCNB2、NEK9、NEK6，检测中心体PTEN、DLG1、Eg5水平；用Western blot检测Eg5磷酸化。
评估肿瘤易感性
验证PDZ-BD缺失对自发及诱导肿瘤的影响
对16个月龄WT、Pten+/ΔTKV、PtenΔTKV/ΔTKV小鼠进行肿瘤筛查；与Eμ-Myc、KrasLA1、DMBA模型杂交或处理，统计肿瘤发生率和种类。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 药物处理 | 莫纳斯罗 | -- | -- |
| BI2536 | Selleck Chemicals | -- | |
| MLN8054 | Selleck Chemicals | -- | |
| 免疫印迹 | 抗Eg5抗体 | Origene | TA301478 |
| 抗Dlg1抗体 | Abcam | ab69737 | |
| 抗Pten抗体 | Cascade BioScience | ABM-2052 | |
| 抗γ-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T6557 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗Myc标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2276S | |
| 抗磷酸化Eg5T927抗体 | BioLegend | 620502 | |
| 抗磷酸化Eg5S1033抗体 | -- | -- | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗磷酸化AKT T308抗体 | Cell Signaling Technology | 2965 | |
| 抗磷酸化AKT S473抗体 | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| 抗Cdh1抗体 | Abcam | ab3242 | |
| 抗Cdc27抗体 | BD Biosciences | 610455 | |
| 抗p53抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-6243 | |
| 抗Plk1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8358 | |
| 抗Aurora B抗体 | BD Biosciences | 611083 | |
| 抗磷酸化Aurora T232抗体 | Cell Signaling Technology | 2914 | |
| 抗细胞周期蛋白B1抗体 | Cell Signaling Technology | 4138 | |
| 抗细胞周期蛋白B2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-22776 | |
| 抗4E-BP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9451 | |
| 抗S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 | |
| 抗NEK6抗体 | Abcam | 133494 | |
| 抗NEK9抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-100401 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| 抗磷酸化组蛋白H3Ser10抗体 | Millipore | 06-570 | |
| 抗B220抗体 | BD Biosciences | 550286 | |
| 抗CD3抗体 | Abcam | ab5690 | |
| DNA纤维分析 | CIdU | Sigma-Aldrich | C6891 |
| IdU | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 免疫荧光 | 抗磷酸化组蛋白H2AX抗体 | Millipore | 05-636 |
| 抗53BP1抗体 | Novus Biologicals | NB100-305 | |
| 抗磷酸化CenpA抗体 | Millipore | 04-792 | |
| 抗着丝粒抗体 | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | |
| 抗磷酸化Knl1抗体 | -- | -- | |
| AlexaFluor 488标记的山羊抗大鼠IgG | Molecular Probes | -- | |
| AlexaFluor 594标记的山羊抗小鼠IgG | Molecular Probes | -- | |
| 显微镜成像 | LSM 510激光扫描共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| LSM 780激光扫描共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| Axiovert 100 M倒置显微镜 | Zeiss | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 6.0 | GraphPad | -- |
| Microsoft Excel | Microsoft | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | PtenΔTKV/ΔTKV小鼠的遗传背景（129Sv/E × C57BL/6）；小鼠饲养环境（无特定病原体屏障）；伦理审查（IACUC） 阅读提示：Methods: Mouse strains |
| 细胞培养 | HT1299细胞培养条件（RPMI培养基+10% FCS）；MEFs原代培养方法；细胞系身份验证（STR分析） 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 染色体分离分析 | MEFs解冻时间和代数（P5）；秋水仙胺处理浓度和时间；活细胞成像的细胞密度和拍摄频率；染色体计数标准（50个中期分裂相） 阅读提示：Methods: Aneuploidy analyses; Live-cell imaging |
| 中心体运动分析 | 细胞固定和透化条件（PTEN/DLG1染色需先用PHEM透化）；γ-tubulin和α-tubulin抗体稀释倍数；中心体距离和纺锤体角度测量标准 阅读提示：Methods: Centrosome separation and spindle geometry measurements |
| 蛋白相互作用分析 | 免疫沉淀所用抗体（anti-Pten, anti-Dlg1, anti-Eg5）；裂解液成分和洗涤条件；免疫印迹检测的磷酸化修饰位点（Thr926, Ser1033） 阅读提示：Methods: Western blot analysis, immunoprecipitations |
| 肿瘤发生分析 | 自发肿瘤观察时间（16个月）；DMBA剂量和处理方案；肿瘤类型和组织病理学分析；Eμ-Myc和KrasLA1杂交策略 阅读提示：Methods: Mouse strains |