构建携带HBV pre-S/S基因的转基因小鼠
建立表达野生型或突变型（sW172*）pre-S/S蛋白的体内模型，以评估其独立致癌性。
从pCMV-HBV中分离BglII-BglII片段，构建pTg-WT和pTg-sW172*质粒，通过原核显微注射产生C57BL/6转基因小鼠，鉴定四个品系（TgWT-L、TgWT-H、TgSW172*-L、TgSW172*-H），并验证蛋白表达水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
携带乙型肝炎病毒pre-S/S基因及sW172*突变的转基因小鼠的肝癌发生
Hepatocarcinogenesis in transgenic mice carrying hepatitis B virus pre-S/S gene with the sW172* mutation.
实验完整度
高包含转基因小鼠模型（四系）、组织病理学分析、分子机制验证（western blot、IHC、TUNEL）、微阵列分析及细胞实验（miR-873调控）等多个独立证据层级。
主要模型
转基因小鼠（C57B6背景，携带HBV pre-S/S基因，含野生型或sW172*突变） 肝细胞癌细胞系（Hepa1-6、Hep-Y2、Mahlavu、J7、BNL等）
重点核对
转基因小鼠品系：TgWT-L、TgWT-H、TgSW172*-L、TgSW172*-H，各携带单拷贝转基因 观察终点：18月龄时处死，记录HCC发生率 对照：非转基因（Null）小鼠及TgWT（表达野生型pre-S/S）小鼠 样品量：每组24-27只小鼠（合并分析时P=0.0021） 关键检测指标：HBsAg水平、肝组织免疫组化、凋亡（TUNEL）、增殖（Ki-67）、信号蛋白表达（GRP78、pERK1/2等）、miR-873及CSMD3表达
摘要
乙型肝炎病毒（HBV）携带rtA181T/sW172*突变，赋予了对阿德福韦和拉米夫定的交叉耐药性。基于细胞和临床的研究表明，携带该突变的HBV具有增加的致癌潜力。在此，我们创建了转基因小鼠模型来研究含有该突变的HBV pre-S/S基因的致癌性。通过将HBV pre-S/S基因及其自身启动子转入C57B6小鼠，生成了转基因小鼠。共建立了四个品系。其中两个携带野生型基因，并产生高水平和低水平的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）（TgWT-H和L）。另外两个携带sW172*突变，具有高和低的肝内表达水平（TgSW172*-H和L）。在出生后18个月处死时，TgWT小鼠均未发生肝细胞癌（HCC），而TgSW172*-H小鼠6/26（23.1%）和TgSW172*-L小鼠2/24（8.3%）发生HCC（TgWT vs TgSW172* P=0.0021）。肝脏组织的分子分析显示，TgSW172*小鼠中葡萄糖调节蛋白78和磷酸化细胞外信号调节激酶1的表达显著增加，而TgSW172*-H小鼠中B细胞淋巴瘤-extra large的表达降低。TgSW172*-H小鼠中凋亡细胞比例较高，伴随细胞周期蛋白E水平升高，提示肝细胞更新加速。cDNA微阵列和microRNA阵列的联合分析确定了microRNA-873介导的TgSW172*小鼠中CUB和Sushi多个结构域3（CSMD3）蛋白（一种假定肿瘤抑制因子）的表达降低。我们的转基因小鼠实验证实，携带sW172*突变的HBV pre-S/S基因具有增加的致癌潜力。内质网应激反应增强、肝细胞更新加速和CSMD3表达降低共同促进了肝癌发生。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 携带rtA181T/sW172*突变的HBV pre-S/S基因是否具有增加的致癌潜力，及其潜在的分子机制。
- 核心机制
- sW172*截短pre-S/S蛋白通过上调miR-873，靶向抑制CSMD3表达，同时诱导内质网应激反应、肝细胞凋亡增加和代偿性增殖，共同促进肝癌发生。
- 主要证据
- 转基因小鼠中，TgSW172*小鼠HCC发生率显著高于TgWT小鼠（23.1%和8.3% vs 0%）；肝组织分子分析显示GRP78和pERK1/2升高、Bcl-xL降低、凋亡细胞增加；miR-873上调及CSMD3下调在独立的小鼠队列和细胞实验中得到验证。
- 研究意义
- 该研究提供了转基因小鼠证据，证明截短的HBV pre-S/S蛋白（sW172*突变）本身具有增加的致癌性，为抗病毒治疗中出现的S基因突变体的临床风险提供了机制见解，并提示CSMD3可能作为肿瘤抑制因子参与肝癌发生。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估肿瘤发生率和病理特征
确定突变型pre-S/S蛋白是否导致肝细胞癌发生。
18月龄处死小鼠，检查肝脏肿瘤，进行H&E染色和glypican-3免疫组化验证HCC。
分析细胞凋亡和增殖相关信号通路
探索突变型pre-S/S蛋白诱导的细胞学变化。
通过TUNEL、活性caspase-3 IHC、Ki-67 IHC和Western blot分析凋亡、增殖及信号蛋白表达。
筛选和验证差异表达基因及microRNA
寻找导致TgSW172*小鼠肝癌发生而TgWT不发生的差异分子通路。
利用cDNA和microRNA微阵列分析，筛选差异表达基因及miRNA，并通过RT-qPCR和Western blot验证。
验证miR-873调控CSMD3的机制
证明miR-873直接靶向CSMD3 3'-UTR并影响其表达。
在肝癌细胞系中过表达或抑制miR-873，检测CSMD3表达变化；进行荧光素酶报告基因实验验证miR-873与CSMD3 3'-UTR的相互作用；MTT实验评估细胞增殖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 转基因小鼠构建 | pTg-WT | -- | -- |
| pTg-sW172* | -- | -- | |
| HBsAg定量 | Elecsys HBsAg II定量检测 | Roche Diagnostics | -- |
| Western blot/IHC | 单克隆抗-HBs抗体 | Genzyme Diagnostics | M-21853 |
| 山羊多克隆抗-HBs抗体 | Bioss | bs-1557G | |
| 单克隆抗-pre-S2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23944 | |
| HCC病理验证 | 抗-glypican-3抗体 | Abcam | ab66596 |
| Western blot | 抗-GRP78抗体 | Abcam | ab108615 |
| 抗-ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 137F5 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 20G11 | |
| β-肌动蛋白抗体 | GeneTex | -- | |
| 抗Bcl-xL抗体 | Cell Signaling Technology | 54H6 | |
| 抗细胞周期蛋白E抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-481 | |
| 抗-CSMD3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-68281 | |
| 抗-GAPDH抗体 | GeneTex | -- | |
| IHC | 抗-Ki-67抗体 | Merck Millipore | -- |
| 凋亡检测 | DeadEnd荧光TUNEL系统 | Promega Corporation | -- |
| 抗活化caspase 3抗体 | EnoGene Biotech | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| MEM培养基 | Gibco | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen Corporation | -- |
| cDNA合成 | SuperScript III第一链合成系统 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | SYBR Green PCR预混液 | Life Technologies | -- |
| miRNA定量 | NCode VILO miRNA cDNA合成试剂盒 | Life Technologies | -- |
| NCode EXPRESS SYBR GreenER miRNA qRT-PCR试剂盒 | Life Technologies | -- | |
| miR-873抑制 | TOOLSilent shRNA载体 | TOOLS Biotechnology | -- |
| RT-qPCR | ABI 7500实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- |
| 荧光素酶报告实验 | pMIR-REPORT载体 | Applied Biosystems | -- |
| QuikChange多位点定向突变试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 转基因小鼠构建 | 转基因载体构造（pTg-WT和pTg-sW172*）及原核显微注射方法；BglII-BglII HBV-DNA片段；C57BL/6小鼠品系。 阅读提示：参见Materials and methods部分'Construction of transgenic mice' |
| HCC发生率评估 | 观察时间为18月龄；样本量（每组>20只）；HCC诊断标准（H&E染色和glypican-3 IHC）。 阅读提示：参见Results 'Development of HCC in TgSW172* mice'及Table 1 |
| 蛋白表达检测 | 所用抗体（anti-HBs、anti-pre-S2、anti-GRP78等）及稀释度；Western blot和IHC的具体操作步骤。 阅读提示：参见Materials and methods 'Western blot, immunohistochemistry analysis and TUNEL assay' |
| 凋亡和增殖检测 | TUNEL试剂盒及步骤；Ki-67和活性caspase-3 IHC条件；信号蛋白表达分析（GRP78、Bcl-xL、cyclin E、pERK1/2）。 阅读提示：参见Materials and methods及Results 'Increased ER stress response and hepatocyte turnover' |
| 微阵列分析 | cDNA和miRNA阵列平台（Affymetrix GeneChip）；每组样本数（3只小鼠）；差异表达筛选标准（fold-change和p值）。 阅读提示：参见Materials and methods 'cDNA microarray'和'microRNA array' |
| miR-873靶向验证 | 细胞系来源及培养条件；miR-873抑制或过表达载体的使用；荧光素酶报告基因实验条件。 阅读提示：参见Materials and methods 'Inhibition of microRNA-873 expression'和'3'-UTR luciferase reporter assay' |