构建基因敲除小鼠模型
研究TREX1缺失对小鼠生存和炎症表型的影响，并验证STING依赖性。
使用TREX1−/−（TKO）、STING−/−（SKO）和双敲除（STKO）小鼠，观察生存率、心脏大体形态和组织病理学变化。
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内源性自身DNA触发依赖STING的炎症性疾病
Intrinsic self-DNA triggers inflammatory disease dependent on STING.
实验完整度
高包含基因敲除小鼠模型、细胞实验、骨髓移植和组织病理学等多层级验证，并明确功能验证（骨髓移植）和机制验证（DNA泄漏、STING依赖性）。
主要模型
TREX1−/−小鼠（TKO小鼠） 骨髓来源巨噬细胞（BMDM） 骨髓来源树突状细胞（BMDC） 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）
重点核对
TKO小鼠与STKO小鼠的基因型及STING依赖性 骨髓移植中供体与受体的基因型（WT、TKO、STKO）及细胞数量（5 × 10^6） 细胞同步化处理（胸苷、诺考达唑）及释放后检测时间点（0、8、24小时） 检测的促炎细胞因子和趋化因子（IFN-β、TNF、IL-6、CXCL10等）
摘要
诸如Aicardi–Goutières综合征和严重系统性红斑狼疮等炎症性疾病通常是致死性疾病，已追溯至外切核酸酶TREX1（DNase III）的缺陷。缺乏TREX1的小鼠同样在早期因类似症状（包括炎症性心肌炎）死亡，通过慢性激活干扰素基因刺激因子（STING）通路。在本研究中，我们证明吞噬细胞而非肌细胞主要负责引起炎症，这一结果可通过将正常骨髓过继转移至TREX1−/−小鼠中而得到缓解。与正常巨噬细胞相比，TREX1−/−巨噬细胞在暴露于依赖STING的激活剂后并未表现出显著增强的产生促炎细胞因子的能力，而是表现为被基因组DNA慢性刺激。这些结果为炎症提供了分子层面的见解，并为设计新疗法提供了概念。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TREX1缺陷引起的炎症性疾病中，哪种细胞类型是导致炎症的主要原因，以及其内在机制是什么？
- 核心机制
- TREX1缺陷的吞噬细胞（巨噬细胞和树突状细胞）在无刺激情况下，因细胞周期中泄漏至胞质的基因组DNA持续激活STING通路，导致基础水平的促炎细胞因子和趋化因子产生，进而吸引免疫细胞浸润心脏等组织，引发炎症性心肌炎。
- 主要证据
- 通过骨髓移植实验证明，将正常骨髓移植至TKO小鼠可减轻炎症并延长生存期，而将TKO骨髓移植至WT小鼠则诱发炎症；TREX1缺陷的巨噬细胞和树突状细胞在静息状态下高表达IFIT3、CXCL10等STING依赖基因；FISH实验显示TREX1缺陷细胞在细胞周期中胞质DNA积累。
- 研究意义
- 该研究为自身DNA介导的炎症性疾病提供了分子机制见解，并提示骨髓过继转移疗法可能对TREX1相关的AGS和SLE患者有益，同时指出了潜在的新的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基因表达谱分析
鉴定TREX1缺失时心脏和巨噬细胞中差异表达的基因和通路。
采用Illumina BeadChip芯片分析心脏和BMDMs的转录组，并通过RT-PCR验证关键炎症因子。
体外细胞实验
评估TREX1缺陷对巨噬细胞和树突状细胞对STING配体反应性的影响及基础激活状态。
分离BMDMs和BMDCs，用dsDNA90、cGAMP或HSV-1感染刺激，检测IFN-β等细胞因子；同时在无刺激条件下检测基础表达水平。
骨髓移植实验
确定造血细胞在TREX1缺陷疾病中的致病作用。
将WT、TKO或STKO小鼠的骨髓细胞转移至经照射的TKO或WT小鼠，分析生存率、体重、心脏炎症及血清因子。
细胞周期同步化与胞质DNA检测
探究TREX1缺陷导致的基础激活是否源于细胞周期中泄漏的自身DNA。
用胸苷和诺考达唑同步BMDCs，释放后在不同时间点检测细胞因子表达；通过FISH检测BMDMs中胞质DNA。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 巨噬细胞集落刺激因子 | R&D Systems | -- |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | BioLegend | -- | |
| 骨髓移植 | 抗Thy1.2抗体 | -- | HO-13.4 |
| Low-Tox-M兔补体 | Cedarlane Laboratories | -- | |
| 免疫印迹 | 抗TREX1抗体 | BD Biosciences | 611987 |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| 免疫组织化学 | 抗CD68抗体 | Serotec | MCA1957 |
| 抗CD11c抗体 | Bioss | bs-2508R | |
| 抗ICAM1抗体 | Abcam | ab124759 | |
| 抗CXCR3抗体 | Biorbyt | orb135585 | |
| 基因表达分析 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| Bioanalyzer RNA 6000 Nano试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina Sentrix BeadChip芯片 | Affymetrix | mouse WG6 version 2 | |
| RT-qPCR | TaqMan基因表达检测 | Applied Biosystems | -- |
| ELISA | VeriKine小鼠IFN-β ELISA试剂盒 | PBL Assay Science | 42400-1 |
| Procarta细胞因子检测试剂盒 | Affymetrix | -- | |
| 免疫组织化学 | Borg Decloaker抗原修复液 | Biocare Medical | -- |
| ImmPRESS试剂 | Vector Laboratories | -- | |
| DAB底物试剂盒 | Vector Laboratories | -- | |
| FISH | 小鼠着丝粒探针 | Kreatech | KI-30500G |
| 细胞学FISH辅助试剂盒 | Dako | -- | |
| ProLong抗淬灭剂 | Molecular Probes | -- | |
| 显微镜观察 | Leica SP5光谱共聚焦倒置显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠基因型（TKO、STKO、SKO、WT）及构建方法；TKO小鼠的中位寿命（约8-10周）；小鼠的周龄（10周龄用于组织分析） 阅读提示：参见Materials and Methods中的'Mice'部分及Figure legends中的Fig. 1A |
| 细胞培养 | BMDMs和BMDCs的分离方法（8-10周龄小鼠后肢股骨）、分化因子及浓度（M-CSF和GM-CSF均为10 ng/ml）、培养时间（未明确说明） 阅读提示：参见Materials and Methods中的'Primary cell culture'部分 |
| 骨髓移植 | 供体和受体小鼠基因型、受体照射条件（650 rads两次）、骨髓细胞数量（5 × 10^6）、T细胞去除方法、移植后分析时间点（4周和12周） 阅读提示：参见Materials and Methods中的'Bone marrow transplantation'部分及Figure legends中的Fig. 3 |
| 基因表达分析 | 心脏和BMDMs的RNA提取方法、芯片类型（Illumina Sentrix BeadChip, mouse WG6 version 2）、数据标准化和统计阈值（p ≤ 0.05） 阅读提示：参见Materials and Methods中的'Gene array analysis'和'Quantitative real-time PCR'部分 |
| 细胞刺激与检测 | 刺激物浓度（dsDNA90 4 µg/ml, cGAMP, HSV-1 MOI=1）、处理时间（16小时）、细胞密度（3 × 10^4 cells/well）、检测指标（IFN-β, IL-1β等） 阅读提示：参见Figure legends中的Fig. 2A和Materials and Methods中的'ELISA'部分 |
| 细胞同步化 | 胸苷浓度（2 mM）和处理时间（24小时）、释放时间（3小时）、诺考达唑浓度（100 ng/ml）和处理时间（过夜）、检测时间点（0, 8, 24小时） 阅读提示：参见Materials and Methods中的'BMDC synchronization'部分和Figure legends中的Fig. 4A和4B |
| FISH分析 | 固定方法（3.7%甲醛）、变性条件（75°C, 10分钟）、杂交条件（37°C, 过夜）、探针类型（小鼠着丝粒探针） 阅读提示：参见Materials and Methods中的'Fluorescence in situ hybridization for synchronized cells'部分 |