微阵列分析鉴定缺氧响应基因
无偏倚地鉴定缺氧对原代成肌细胞基因表达的影响
对缺氧（1% O2）和常氧（21% O2）条件下培养2天的原代成肌细胞进行微阵列分析，鉴定差异表达基因。
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缺氧通过p53蛋白依赖的Bhlhe40蛋白诱导抑制肌原性分化
Hypoxia Inhibits Myogenic Differentiation through p53 Protein-dependent Induction of Bhlhe40 Protein.
实验完整度
高包含微阵列分析、细胞功能获得/缺失实验、ChIP机制验证、缺氧条件下挽救实验及HIF1α敲除动物验证，证据层级多样。
主要模型
卫星细胞来源的原代成肌细胞 C2C12成肌细胞系 HIF1α条件敲除小鼠（Myf5Cre/HIF1αfl/fl）来源的成肌细胞
重点核对
缺氧处理条件（1% O2）及处理时间（48小时） Bhlhe40敲低使用shRNA（pLKO.1-Bhlhe40 shRNA）和嘌呤霉素筛选浓度（1 μg/ml） p53抑制剂Pifithrin-α（PFT）处理浓度（5 μM） 分化诱导条件（血清撤除）及分化时间（1-3天） ChIP实验中使用Bhlhe40-FLAG质粒和FLAG抗体
摘要
卫星细胞是肌肉驻留的干细胞，能够自我更新和分化以修复受损肌肉。然而，肌肉损伤常导致缺血性缺氧环境，阻碍卫星细胞分化并降低肌肉再生的效率。在这里，我们进行了微阵列分析，并鉴定了碱性螺旋-环-螺旋转录因子Bhlhe40作为缺氧抑制肌原性效应的候选介导因子。Bhlhe40在卫星细胞来源的原代成肌细胞中被缺氧强烈诱导。Bhlhe40的过表达抑制Myog表达并模拟缺氧对肌生成的影响。相反，抑制Bhlhe40会上调Myog表达并促进肌原性分化。重要的是，Bhlhe40敲低可挽救缺氧条件下的肌原性分化。在机制上，Bhlhe40结合Myog启动子的近端E-box，并降低MyoD在Myog上的结合亲和力和转录活性。有趣的是，缺氧诱导Bhlhe40表达不依赖于HIF1α，而是通过一种新的p53依赖性信号通路。我们的研究确立了Bhlhe40在介导缺氧对肌原性分化的抑制作用中的关键作用，并提示抑制Bhlhe40或p53可能促进缺血性损伤后的肌肉再生。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 缺氧如何抑制肌原性分化，其潜在分子机制是什么？
- 核心机制
- 缺氧通过p53依赖性途径（独立于HIF1α）诱导Bhlhe40表达，Bhlhe40直接结合Myog启动子近端E-box，降低MyoD的结合亲和力和转录活性，从而抑制Myog表达和肌原性分化。
- 主要证据
- 微阵列分析鉴定缺氧诱导的Bhlhe40（7.7倍上调）；过表达和敲低实验证实Bhlhe40调控Myog表达和分化；ChIP实验显示Bhlhe40结合Myog启动子E-box并调节MyoD结合；敲低Bhlhe40或抑制p53可挽救缺氧下的分化缺陷；HIF1α敲除不影响Bhlhe40诱导。
- 研究意义
- 研究表明Bhlhe40在介导缺氧抑制肌生成中的关键作用，提示抑制Bhlhe40或p53可能促进缺血性损伤后的肌肉再生。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Bhlhe40过表达研究
验证Bhlhe40是否足以模拟缺氧对肌原性分化的抑制作用
使用腺病毒在初级成肌细胞中过表达Bhlhe40，通过血清撤除诱导分化，检测形态学变化、分化指数、Myog和MyoD表达。
Bhlhe40敲低研究
验证Bhlhe40是否为肌原性分化所必需
使用慢病毒shRNA在初级成肌细胞和C2C12细胞中敲低Bhlhe40，检测Myog表达、分化指数和融合指数。
ChIP机制分析
验证Bhlhe40是否直接结合Myog启动子并影响MyoD结合
在初级成肌细胞中过表达Bhlhe40-FLAG并敲低Bhlhe40，使用ChIP检测Bhlhe40和MyoD在Myog启动子E-box区域的富集。
缺氧条件下挽救实验
验证Bhlhe40敲低是否能挽救缺氧导致的肌原性分化缺陷
初级成肌细胞感染对照或Bhlhe40KD慢病毒，在缺氧条件下诱导分化，检测分化指数和Myog表达。
p53通路验证
确定缺氧诱导Bhlhe40的分子通路是否依赖p53
用p53抑制剂PFT处理成肌细胞，检测Bhlhe40表达；在HIF1α敲除成肌细胞中检测Bhlhe40表达；评估PFT对缺氧条件下分化的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 原代细胞分离 | I型胶原酶 | -- | -- |
| 分散酶B | Roche Applied Science | -- | |
| 细胞培养 | F-10 Ham培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 基质胶 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 马血清 | -- | -- | |
| 缺氧处理 | 模块化培养箱 | Billups-Rothenberg | -- |
| 药物处理 | 皮菲色林-α | Sigma | -- |
| 微阵列分析 | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| Agilent全小鼠基因组寡核苷酸微阵列8x60,000 | Agilent Technologies | -- | |
| DNA微阵列扫描仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 腺病毒生产 | pAdTrack-CMV质粒 | -- | -- |
| pAdEasy-1质粒 | -- | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | -- | |
| 免疫染色 | 山羊血清 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| MF20抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | -- | |
| 荧光显微镜 | Leica DM 6000B荧光显微镜 | Leica | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RNA处理 | 无RNase的DNase I | -- | -- |
| RNA浓度测定 | Nanodrop 3000分光光度计 | Thermo Fisher | -- |
| cDNA合成 | 莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶 | -- | -- |
| RT-qPCR | Roche Lightcycler 480 PCR系统 | Roche | -- |
| SYBR Green预混液 | -- | -- | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白质定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂 | Pierce | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore Corp. | -- |
| MyoD抗体 | Santa Cruz Biotechnology | M318 | |
| Myog抗体 | Santa Cruz Biotechnology | F5D | |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | 6C5 | |
| Bhlhe40/Sharp2抗体 | Abcam | ab23794 | |
| FLAG抗体 | Cell Signaling Technology | 2368 | |
| p53抗体 | Bioss | bs-0033R | |
| ECL Western印迹底物 | Pierce | -- | |
| Western blot成像 | FluoChem R成像系统 | ProteinSimple | -- |
| 敲低实验 | pLKO.1-Bhlhe40 shRNA质粒 | Thermo Scientific | TRCN0000081853 |
| 慢病毒生产 | pHR'-CMV-ΔR8.20vpr质粒 | -- | -- |
| pHR'-CMV-VSV-G质粒 | -- | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| ChIP | pCMV-FLAG-2b质粒 | -- | -- |
| 甲醛 | -- | -- | |
| 甘氨酸 | -- | -- | |
| SDS裂解缓冲液 | -- | -- | |
| Cycle Pure试剂盒 | Omega | -- | |
| 动物模型 | HIF1αfl/fl小鼠 | The Jackson Laboratory | 007561 |
| Myf5Cre小鼠 | The Jackson Laboratory | 007893 | |
| MyoDiCre小鼠 | The Jackson Laboratory | 014140 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分离与培养 | 原代成肌细胞分离方法（胶原酶和分散酶B消化），培养基组成（F-10 Ham's培养基，17% FBS，4 ng/ml bFGF，1%青霉素-链霉素），分化诱导培养基（DMEM，2%马血清，1%青霉素-链霉素），培养条件（5% CO2，常氧或1% O2缺氧） 阅读提示：Experimental Procedures 下的 'Primary Myoblast Isolation, Culture, and Differentiation' |
| 缺氧处理 | 缺氧条件（1% O2），处理时间（48小时），使用的设备（Billups-Rothenberg模块化培养箱），气体混合物（5%空气、5% CO2、90% N2） 阅读提示：Experimental Procedures 下的 'Primary Myoblast Isolation, Culture, and Differentiation' |
| 药物处理 | p53抑制剂Pifithrin-α（PFT）浓度（5 μM），处理时间（4小时用于mRNA分析，48小时用于蛋白和分化分析） 阅读提示：Experimental Procedures 下的 'Primary Myoblast Isolation, Culture, and Differentiation' |
| 微阵列分析 | RNA质量（RIN > 8.2），杂交平台（Agilent全鼠基因组寡核苷酸微阵列8x60,000），标记（Cy3和Cy5），分析软件（Agilent feature extraction software，DAVID 6.7） 阅读提示：Experimental Procedures 下的 'Microarray Analysis of Myoblasts under Hypoxic Conditions' |
| 过表达实验 | 腺病毒转导时间（1天），转导后病毒-free培养基培养时间（至少1天），分化诱导时间（1-3天） 阅读提示：Experimental Procedures 下的 'Adenovirus Production to Overexpress Bhlhe40' 和 'Results' 相关部分 |
| 敲低实验 | 慢病毒感染时间（2天），嘌呤霉素筛选浓度（1 μg/ml）和筛选时间（2天），分化时间（1-3天） 阅读提示：Experimental Procedures 下的 'Knockdown of Bhlhe40 Using Lentivirus' 和 'Results' 相关部分 |
| ChIP实验 | Bhlhe40-FLAG质粒电转，Bhlhe40 shRNA慢病毒感染作为阴性对照，甲醛交联时间（10分钟），甘氨酸终止时间（5分钟），Myog启动子E1/E2区域扩增引物 阅读提示：Experimental Procedures 下的 'Chromatin Immunoprecipitation' |
| 统计设计 | 数据表示（mean ± S.E.），统计检验（非配对双尾Student's t检验），显著性阈值（p < 0.05） 阅读提示：Experimental Procedures 下的 'Statistical Analysis' |