Ndr1/2敲低对海马神经元极性建立的影响
确定Ndr激酶是否参与神经元极性的建立。
在0 DIV（铺板后2小时内）转染E18大鼠海马神经元，使用针对Ndr1和Ndr2的shRNA进行单敲低或双敲低，在3 DIV固定并用Tau-1和MAP2染色，统计具有单轴突、多轴突或无轴突的神经元比例。同时通过共表达RNAi抗性Ndr1M或Ndr2M进行拯救实验。
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Rassf5 和 Ndr 激酶通过 Par3 磷酸化在一条新通路中调控神经元极性
Rassf5 and Ndr kinases regulate neuronal polarity through Par3 phosphorylation in a novel pathway.
实验完整度
高包含体外培养海马神经元、HEK293T细胞、体内敲除小鼠及外源电穿孔脑片培养等多层级实验，并通过功能拯救和机制验证确认通路。
主要模型
E18大鼠海马神经元培养 HEK 293T细胞 Rassf5敲除小鼠原代海马神经元 E14.5小鼠脑片活体电穿孔培养
重点核对
在0 DIV（铺板后2小时内）转染神经元以敲低Ndr1/2或Rassf5 定量具有单轴突、多轴突或无轴突的神经元百分比（对照约74%单轴突，Ndr1/2双敲低降至50%，Rassf5敲低约50%形成多轴突） 使用Ndr2-T442D磷酸化模拟突变体拯救Rassf5敲低表型 通过磷酸化特异抗体检测Par3 Ser383磷酸化水平，并利用Par3-S383D模拟磷酸化突变体进行功能拯救
摘要
细胞的形态和极性生长依赖于控制调控因子不对称分布的信号通路。进化上保守的 Ndr 激酶在酵母和无脊椎动物的细胞极性和形态发生中发挥重要作用，但尚不清楚它们在哺乳动物细胞中是否具有类似功能。本文分析了哺乳动物 Ndr1 和 Ndr2（分别为 STK38 和 STK38L）在神经元极性建立中的作用。我们表明它们在肿瘤抑制因子 Rassf5 下游和极性蛋白 Par3 上游发挥作用。在海马神经元的极化过程中，Rassf5 和 Ndr1 或 Ndr2 是必需的，以阻止超数轴突的形成。机制上，Ndr 激酶通过磷酸化 Par3 的 Ser383 来抑制其与动力蛋白的相互作用，从而使 Par3 的分布极化并强化轴突特化。我们的结果鉴定了一条新的 Rassf5–Ndr–Par3 信号级联，该级联在神经元极性建立过程中调控 Par3 的运输。它们在神经元极性中的作用提示 Ndr 激酶作为细胞极性调控因子发挥保守功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哺乳动物Ndr激酶是否在神经元极性建立中发挥功能，其上游调控因子和下游底物是什么？
- 核心机制
- Rassf5通过激活Ndr激酶（Ndr1/2），使其磷酸化Par3的Ser383，进而阻断Par3与动力蛋白亚基Dlic2的相互作用，促进Par3不对称分布于轴突，从而建立并强化神经元极性，防止超数轴突形成。
- 主要证据
- 在海马神经元中敲低Ndr1/2或Rassf5导致多轴突形成，而表达RNAi抗性Ndr1/2或Rassf5可拯救；Ndr2-T442D或Par3-S383D磷酸化模拟突变体可分别拯救Rassf5或Ndr1/2敲低表型；磷酸化特异性抗体证实Par3 Ser383在轴突中富集，且其磷酸化依赖于Ndr及Rassf5；免疫共沉淀显示Par3-S383D与Dlic2的结合几乎完全消失。
- 研究意义
- 该研究揭示了一条新的Rassf5–Ndr–Par3信号级联，其调控神经元极性建立，提示Ndr激酶作为细胞极性调控因子可能发挥保守功能，并可能在其他极性细胞（如上皮细胞）中具有重要作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Rassf5敲低对海马神经元极性建立的影响
确定Rassf5是否参与神经元极性建立及其与Ndr激酶的上下游关系。
在0 DIV转染E18大鼠海马神经元，使用Rassf5 shRNA敲低，3 DIV固定染色统计神经元极性。并通过共表达RNAi抗性Rassf5M或Ndr2-T442D磷酸化模拟突变体进行拯救实验。
Rassf5敲低在脑片培养中对神经元极化的影响
验证Rassf5在体内环境中对神经元极性的功能。
通过外源电穿孔将Rassf5 shRNA和GFP载体导入E14.5小鼠胚胎脑，36小时后使用活细胞成像观察脑片培养中神经元从多极向双极形态的转变及迁移情况。
Ndr2对Par3的磷酸化及位点鉴定
验证Ndr激酶是否直接磷酸化Par3并确定磷酸化位点。
通过体外激酶实验，将纯化的GST-Par3-PDZ1/2与HA-Ndr2-PIF或激酶死亡突变体共孵育，使用磷酸化特异性抗体检测Ser383磷酸化；通过质谱鉴定Ndr2磷酸化Par3的位点。
Par3磷酸化功能验证
验证Par3 Ser383磷酸化对神经元极性建立的必要性。
在Ndr1/2双敲低或Rassf5敲低的神经元中，分别共表达非磷酸化突变体Par3-S383,1196A或磷酸化模拟突变体Par3-S383,1196D，3 DIV固定染色统计神经元极性表型。
Par3磷酸化对其亚细胞定位及Dlic2相互作用的影响
探究Ser383磷酸化如何改变Par3的分布及其分子机制。
在海马神经元中表达Myc-Par3-S383A或Myc-Par3-S383D，免疫荧光检测其亚细胞分布；在HEK293T细胞中共表达RFP-Dlic2和Myc-Par3突变体，免疫共沉淀检测相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Neurobasal培养基 | Life Technologies | -- |
| Opti-MEM培养基 | Life Technologies | -- | |
| B27补充剂 | -- | -- | |
| N2补充剂 | -- | -- | |
| 免疫染色 | Tau-1抗体 | Chemicon | MAB3420 |
| MAP2抗体 | Chemicon | AB5622 | |
| Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2272 | |
| Par3抗体 | Upstate | 07-330 | |
| 磷酸化Par3 (Ser383)抗体 | Eurogentec | -- | |
| NDR-CTD抗体 | -- | -- | |
| Rassf5抗体 | Bioss | bs-11168R | |
| Alexa Fluor偶联二抗 | Molecular Probes | -- | |
| Western blot | 抗FLAG M2抗体 | Sigma | F3165 |
| 抗GFP抗体 | BabCo | MMS-118P | |
| 抗HA抗体 | Sigma | H6908 | |
| 抗HA抗体 | Roche | 1867423 | |
| 抗Par3抗体 | Upstate | 07-330 | |
| 抗Myc抗体 | Roche | 1667149 | |
| 抗RFP抗体 | Evrogen | 23402290601 | |
| HRP偶联二抗 | Dianova | -- | |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽-琼脂糖 | GE Healthcare | -- |
| Protein G-琼脂糖珠 | Roche | -- | |
| Complete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 质粒构建 | QuikChange定点突变试剂盒 | Stratagene | -- |
| 体外电穿孔 | ECM-830 BTX方波电穿孔仪 | BTX, Gentronic | -- |
| 活细胞成像 | 蔡司LSM 700激光扫描显微镜 | Carl Zeiss MicroImaging | -- |
| 脑片制备 | 振动切片机 | Leica | -- |
| 脑片培养 | Millicell组织培养插入小室 | Millipore | -- |
| 质粒构建 | pTagRFP-N载体 | Evrogen | FP142 |
| pSHAG-MAGIC2载体 | -- | -- | |
| pCAGGS-U6载体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 海马神经元培养与转染 | E18大鼠海马神经元，转染时间需在铺板后2小时以内，转染DNA量6 µg，CaCl2浓度1 M，共6.25 µl，转染后45分钟，37°C、5% CO2 阅读提示：Materials and Methods, Cell culture and transfection |
| Ndr1/2敲低与极性分析 | shRNA靶序列（NDR1: GACATGATGACTTTATTGA; Ndr2: GCAGCATGCTCGTAAAGAA），3 DIV固定，Tau-1和MAP2染色，统计无轴突、单轴突、多轴突神经元比例，需双敲低才会引起表型 阅读提示：Results, 第一段；Figure 1C,D；Materials and Methods, Plasmids |
| Rassf5敲低与拯救 | Rassf5 shRNA靶序列（GACAAGTGCTCTTCCAGAA），RNAi抗性Rassf5M，Ndr2-T442D和T442A突变体，0 DIV转染，3 DIV固定 阅读提示：Results, Rassf5 is required...；Figure 2C,D；Figure 3B,C |
| Par3磷酸化功能验证 | Ndr1/2 shRNA或Rassf5 shRNA共转染，Par3-S383,1196A和Par3-S383,1196D突变体，3 DIV固定，Tau-1/MAP2染色 阅读提示：Results, The phosphorylation of Par3...；Figure 5F,G；Figure 6C,D |
| 免疫共沉淀检测Par3与Dlic2相互作用 | HEK293T细胞共表达RFP-Dlic2和Myc-Par3 WT/S383A/S383D，抗RFP免疫沉淀，抗Myc检测 阅读提示：Results, The phosphorylation of Par3 changes its distribution；Figure 7C |