检测AD患者脑中VDAC1蛋白水平
明确VDAC1水平是否随AD进展（Braak分期）变化。
使用免疫印迹和定量密度测定法，检测不同Braak分期AD患者和对照前额叶皮层组织中的VDAC1蛋白水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
VDAC1与淀粉样β和磷酸化tau的异常相互作用导致阿尔茨海默病中的线粒体功能障碍
Abnormal interaction of VDAC1 with amyloid beta and phosphorylated tau causes mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease.
实验完整度
高包含AD患者脑标本、多种转基因小鼠模型（APP、APP/PS1、3xTg-AD）的分子互作（免疫共沉淀、免疫荧光）和线粒体功能多指标验证（H2O2、细胞色素氧化酶、ATP等），证据层级多元。
主要模型
AD患者额叶皮层标本 APP (Tg2576) 转基因小鼠 APP/PS1 转基因小鼠 3xTg-AD 转基因小鼠
重点核对
AD患者Braak分期（I-II, III-IV, V-VI）与对照组（Braak 0期）脑组织VDAC1蛋白水平比较 6、12、24月龄APP转基因小鼠与年龄匹配WT小鼠脑皮层VDAC1蛋白水平比较 AD患者及APP、APP/PS1、3xTg-AD小鼠脑皮层中VDAC1与Aβ（单体、寡聚体）及磷酸化tau的免疫共沉淀相互作用 6、12、24月龄APP与WT小鼠皮层线粒体H2O2产生、细胞色素氧化酶活性、ATP水平和GTPase活性等指标比较
摘要
我们研究的目的是确定电压依赖性阴离子通道蛋白1（VDAC1）与阿尔茨海默病（AD）中淀粉样β（Aβ）和磷酸化tau之间的关系。使用AD患者、对照受试者以及6、12和24月龄的淀粉样β前体蛋白（APP）转基因小鼠的脑标本，我们研究了VDAC1蛋白水平。此外，我们还使用AD患者、对照受试者、APP、APP/PS1和3XTg.AD小鼠的皮层组织，研究了VDAC1与Aβ（单体和寡聚体）和磷酸化tau之间的相互作用。我们还研究了APP和非转基因野生型（WT）小鼠中与年龄和VDAC1相关的突变APP/Aβ诱导的线粒体功能障碍。我们发现，与对照受试者相比，AD患者大脑皮层组织中VDAC1水平逐渐升高，且与年龄匹配的对照WT小鼠相比，6、12和24月龄APP转基因小鼠大脑皮层中VDAC1水平显著升高。有趣的是，我们发现VDAC1与AD患者以及APP、APP/PS1和3XTg.AD小鼠大脑中的Aβ和磷酸化tau相互作用。我们发现APP小鼠相对WT小鼠线粒体功能障碍逐渐加重。这些观察使我们得出结论，VDAC1与Aβ相互作用，而磷酸化tau可能反过来阻断线粒体孔道，导致AD发病机制中的线粒体功能障碍。基于当前研究的观察，我们提出降低VDAC1、Aβ和磷酸化tau的水平可能减少VDAC1与APP、VDAC1与Aβ以及VDAC1与磷酸化tau之间的异常相互作用；并且降低VDAC1、Aβ和磷酸化tau的水平可能维持正常的线粒体孔道开放和关闭，最终导致线粒体功能正常，线粒体向神经末梢提供ATP并增强AD中的突触和认知功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在阿尔茨海默病中，VDAC1蛋白水平如何变化，且VDAC1是否与Aβ和磷酸化tau相互作用并导致线粒体功能障碍？
- 核心机制
- VDAC1与Aβ（单体和寡聚体）及磷酸化tau异常相互作用，可能阻塞线粒体孔道，损害氧化磷酸化，导致线粒体功能障碍，进而参与AD发病。
- 主要证据
- AD患者不同Braak分期皮层VDAC1水平进行性升高；6、12、24月龄APP转基因小鼠皮层VDAC1升高，且与年龄相关；免疫共沉淀和免疫荧光证实AD患者及APP、APP/PS1、3xTg-AD小鼠中VDAC1与Aβ和磷酸化tau相互作用；APP小鼠皮层线粒体H2O2产生、脂质过氧化、GTPase活性升高，细胞色素氧化酶活性和ATP产生降低。
- 研究意义
- 该研究提出降低VDAC1、Aβ和磷酸化tau水平可能减少VDAC1与APP/Aβ/磷酸化tau的异常相互作用，维持线粒体孔道正常开放关闭，从而恢复线粒体功能，为AD治疗提供潜在方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测APP转基因小鼠脑中VDAC1蛋白水平
探讨VDAC1水平是否随年龄和突变APP/Aβ表达而变化。
使用免疫印迹和定量密度测定法，检测不同月龄APP（Tg2576）和WT小鼠大脑皮层中的VDAC1蛋白水平。
验证VDAC1与Aβ的相互作用
确定VDAC1是否与Aβ单体和/或寡聚体以及全长APP相互作用。
使用AD患者和对照脑组织及20月龄APP、APP/PS1小鼠脑组织，进行免疫共沉淀实验，用VDAC1抗体沉淀，再用Aβ抗体（6E10）和寡聚体特异性抗体（A11）进行免疫印迹检测。
验证VDAC1与磷酸化tau的相互作用
确定VDAC1是否与磷酸化tau相互作用。
使用AD患者和对照脑组织及13月龄APP、APP/PS1、3xTg-AD小鼠脑组织，进行免疫共沉淀实验，分别用VDAC1抗体和磷酸化tau抗体进行沉淀和交叉验证免疫印迹。
组织学共定位分析
在组织水平确认VDAC1与Aβ、APP和磷酸化tau的共定位，验证生化相互作用。
使用AD患者和APP、3xTg-AD小鼠的脑切片，进行VDAC1与Aβ/APP、及VDAC1与磷酸化tau的双重免疫荧光标记分析。
评估APP小鼠线粒体功能
明确突变APP/Aβ是否导致线粒体功能障碍。
检测不同月龄APP和WT小鼠大脑皮层线粒体的H2O2产生、细胞色素氧化酶活性、脂质过氧化（4-羟基壬烯醛）、ATP产生和分裂相关GTPase活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹 | Nu-PAGE凝胶 | Invitrogen | -- |
| PVDF膜 | Novax, Inc. | -- | |
| β-肌动蛋白抗体 | Chemicon, Millipore with Sigma-Aldrich | -- | |
| VDAC1抗体 | Abcam | -- | |
| Supersignal West Pico化学发光试剂 | Thermo Scientific | -- | |
| 免疫共沉淀 | Dynabeads免疫沉淀试剂盒 | Invitrogen | -- |
| VDAC1抗体 | Bioss USA antibody | -- | |
| tau抗体 | Thermo Scientific | -- | |
| 免疫共沉淀/免疫印迹 | 6E10抗体 | Covance | -- |
| 免疫共沉淀 | A11抗体 | Invitrogen | -- |
| 免疫荧光 | 磷酸化tau抗体 | Pierce Biotechnology, Inc. | -- |
| Tyramide Alexa 594 (红色荧光染料) | Molecular Probes | -- | |
| Alexa 488 (绿色荧光染料) | Molecular Probes | -- | |
| Prolong Gold封片剂 | Molecular Probes | -- | |
| 生物素化二抗 | Vector Laboratories | -- | |
| 线粒体功能检测 | Amplex Red H2O2检测试剂盒 | Molecular Probes | -- |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Pierce Biotechnology | -- | |
| Sigma试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| ATP测定试剂盒 | Molecular Probes | -- | |
| HNE-His ELISA试剂盒 | Cell BioLabs, Inc. | -- | |
| Novus Biologicals比色试剂盒 | Novus Biologicals | -- | |
| 免疫共沉淀 | Dynabeads磁珠 | Invitrogen | -- |
| 免疫印迹 | ImageJ | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 检测AD患者脑中VDAC1蛋白水平 | AD患者不同Braak分期（I-II, III-IV, V-VI）及对照组（Braak 0期）样本数（各n=5）；组织来源（前额叶皮层BA9）；免疫印迹一抗VDAC1（兔子多克隆，1:200） 阅读提示：Materials and Methods: 'Postmortem brain sections from AD patients' 和 'Immunoblotting analysis of VDAC1 protein' |
| 检测APP转基因小鼠脑中VDAC1蛋白水平 | APP（Tg2576）和WT小鼠月龄（6、12、24月龄）及各组样本数（n=5）；组织来源（大脑皮层）；免疫印迹一抗VDAC1稀释度 阅读提示：Materials and Methods: 'Immunoblotting analysis of VDAC1 protein' 和 'APP, APP/PS1 and 3XTg.AD transgenic mice' |
| 免疫共沉淀验证VDAC1与Aβ相互作用 | 脑组织来源（AD患者、对照、20月龄APP/APP/PS1/WT小鼠）；蛋白裂解液用量（500 μg）；VDAC1抗体用量（10 μg）；免疫沉淀后检测用抗体（6E10、A11） 阅读提示：Materials and Methods: 'Co-immunoprecipitation of VDAC1, Aβ, VDAC1 and phosphorylated tau' |
| 免疫共沉淀验证VDAC1与磷酸化tau相互作用 | 脑组织来源（AD患者、对照、13月龄APP/APP/PS1/3xTg-AD/WT小鼠）；蛋白裂解液用量（500 μg）；磷酸化tau抗体（PHF-Tau, S396, Abcam）和VDAC1抗体用量（10 μg） 阅读提示：Materials and Methods: 'Co-immunoprecipitation of VDAC1, Aβ, VDAC1 and phosphorylated tau' |
| 线粒体功能检测 | APP和WT小鼠月龄（6、12、24月龄）及各组样本数（n=5）；检测指标包括H2O2产生、细胞色素氧化酶活性、脂质过氧化（HNE）、ATP水平和GTPase活性；具体试剂盒及操作条件（如Amplex Red试剂盒、Sigma试剂盒等） 阅读提示：Materials and Methods: 'Mitochondrial dysfunction in WT and APP mice' |