高通量筛选药物组合
筛选与西达本胺联合具有协同抗肿瘤效果的药物。
使用高内涵筛选系统，在384孔板中评估西达本胺与7种小分子抑制剂（venetoclax、ibrutinib、idelalisib、GSK-126、5-azacytidine、decitabine、lenalidomide）的5×5剂量矩阵，检测细胞活力和凋亡。
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维奈克拉在转化型滤泡性淋巴瘤的临床前模型中与西达本胺产生合成致死效应
Venetoclax confers synthetic lethality to chidamide in preclinical models with transformed follicular lymphoma.
实验完整度
高文献包含体外细胞系与患者样本验证、体内异种移植模型、转录组测序及Western blot机制验证，明确功能验证与机制验证，且证据层级独立。
主要模型
t-FL细胞系（RL、DOHH2、SU-DHL4、SC-1） SU-DHL4细胞系异种移植（CDX）小鼠模型 B细胞淋巴瘤患者原代样本（n=15） 健康供体外周血单个核细胞（PBMC，n=7）
重点核对
药物浓度：西达本胺（CS055）与维奈克拉（ABT-199）的浓度梯度见补充表S1 处理时间：细胞增殖检测72小时，凋亡检测24小时或48小时 动物模型：SU-DHL4细胞皮下接种NOD/SCID小鼠，当肿瘤体积达100 mm³时给药 给药剂量：西达本胺5 mg/kg/d，维奈克拉10 mg/kg/d，每日灌胃 患者样本：B细胞淋巴瘤患者淋巴结样本15例，健康供体外周血7例
摘要
转化型滤泡性淋巴瘤（t-FL）是一种侵袭性强、异质性高的血液恶性肿瘤，治疗成功率有限；对于t-FL患者，迫切需要开发新的治疗方法。在此，我们利用t-FL细胞系和原代样本进行了高通量筛选（HTS）和体外实验，以评估组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺与BCL-2抑制剂维奈克拉的协同效应。在异种移植模型中进一步测试了体内疗效。维奈克拉与西达本胺的联合治疗在多种t-FL细胞系中显著抑制细胞增殖、诱导凋亡，并使细胞周期阻滞于G0/G1期。此外，联合治疗有效减少了肿瘤负荷，延长了异种移植模型的总生存期，并协同靶向患者样本，同时不损伤正常外周血单个核细胞。机制上，该联合治疗破坏了线粒体膜电位，并调节Wnt信号通路，表现为Wnt3a、Wnt5a/b、β-catenin和磷酸化GSK3β的蛋白表达水平降低。同时，该联合用药通过抑制关键基因HDAC10和BCL-xL，增强了各自原有的抗肿瘤效果。总之，维奈克拉联合西达本胺在t-FL临床前模型中是一种有效的抗癌策略，值得在临床试验中进一步探索以验证其治疗t-FL的有效性和安全性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 转化型滤泡性淋巴瘤（t-FL）缺乏有效治疗，本研究旨在寻找与西达本胺联合的最佳药物组合以增强抗肿瘤疗效。
- 核心机制
- 维奈克拉联合西达本胺通过抑制Wnt信号通路（Wnt3a、Wnt5a/b、β-catenin、磷酸化GSK3β）及调控凋亡相关蛋白（caspase、PARP、Bax）诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，同时抑制HDAC10和BCL-xL表达。
- 主要证据
- 体外细胞系（RL、DOHH2、SU-DHL4、SC-1）和患者样本中联合治疗显著抑制增殖、诱导凋亡；异种移植模型中肿瘤体积减小、生存期延长；RNA-seq和Western blot证实Wnt通路抑制。
- 研究意义
- 维奈克拉联合西达本胺为t-FL患者提供了有潜力的治疗策略，尤其适用于不适合自体干细胞移植或治疗选择有限的患者，值得进一步临床试验验证其安全性和有效性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证联合用药的抗增殖效应
验证西达本胺和维奈克拉联合对t-FL细胞增殖的协同抑制作用。
在RL、DOHH2、SU-DHL4和SC-1细胞系中，用不同浓度单药或联合处理细胞，通过CCK-8检测细胞活力，并计算组合指数（CI）。
凋亡诱导实验
评估联合用药对t-FL细胞凋亡的影响及凋亡途径。
使用Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术检测凋亡率，同时用Western blot检测caspase家族蛋白、PARP等凋亡相关蛋白的表达变化。
线粒体膜电位检测
评估联合用药对线粒体功能的影响。
使用JC-1探针染色，流式细胞术检测线粒体膜电位的变化。
细胞周期分析
评估联合用药对细胞周期分布的影响及机制。
通过PI染色流式细胞术分析细胞周期，Western blot检测细胞周期相关蛋白（Cyclin D1, Cyclin E1, CDK2, CDK4等）。
转录组分析
探索联合用药对基因表达的影响，找出信号通路。
对SU-DHL4细胞（单一及联合处理）进行RNA-seq，分析差异表达基因并进行GO和KEGG富集分析。
Wnt信号通路验证
验证联合用药对Wnt信号通路的抑制作用。
通过Western blot检测Wnt3a, Wnt5a/b, β-catenin, p-GSK3β等蛋白表达。
体内疗效验证
评估联合用药在异种移植模型中的抗肿瘤效果和毒性。
使用SU-DHL4细胞系建立CDX小鼠模型，每天给药，监测肿瘤体积、体重、生存期，并进行HE染色和IHC检测。
原代样本验证
验证联合用药对原代B细胞淋巴瘤细胞的选择性杀伤作用。
收集B细胞淋巴瘤患者淋巴结样本和健康供体外周血，分离细胞后，用Annexin V-FITC/PI染色检测凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
药物筛选与验证
验证细胞功能变化
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Zeta Life | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | -- | |
| Myco-Blue支原体检测试剂盒 | Vazyme Biotech | -- | |
| 药物处理 | 维奈克拉 | TargetMol | T2119 |
| 依鲁替尼 | TargetMol | T1835 | |
| 艾德拉尼 | TargetMol | T1894 | |
| GSK-126 | TargetMol | T2079 | |
| 5-氮杂胞苷 | TargetMol | T1339 | |
| 地西他滨 | TargetMol | T1508 | |
| 来那度胺 | TargetMol | T1642 | |
| 西达本胺 | Chipscreen Biosciences | -- | |
| Z-VAD-FMK | MedChemExpress | -- | |
| 二甲基亚砜 | Sigma | -- | |
| 高通量筛选 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂 | Promega | G7572 |
| Caspase-Glo 3/7发光凋亡检测试剂 | Promega | G8092 | |
| Multidrop Combi分液器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 384孔白色聚苯乙烯板 | Corning | CLS3570 | |
| Nivo多功能酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Zeta Life | -- |
| iMark酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | BD Pharmingen | 556463 |
| 细胞周期检测 | PI/RNase染色缓冲液 | BD Pharmingen | 550825 |
| 流式分析 | CytoFlex S流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| FlowJo软件 | FlowJo | -- | |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1探针 | Signalway Antibody | -- |
| Western blot | PARP抗体 | CST | CA9532 |
| Cleaved PARP抗体 | CST | CA5625 | |
| Caspase-3抗体 | CST | CA9662 | |
| Cleaved Caspase-3抗体 | CST | CA9661 | |
| Caspase-8抗体 | CST | CA4790 | |
| Cleaved Caspase-8抗体 | CST | CA9496 | |
| Caspase-9抗体 | CST | CA9502 | |
| Cleaved Caspase-9抗体 | CST | CA7237 | |
| Mcl-1抗体 | CST | CA4572 | |
| Bcl-xL抗体 | CST | CA2762 | |
| Cyclin E1抗体 | CST | CA4129 | |
| Cyclin D1抗体 | CST | CA2922 | |
| c-Myc抗体 | CST | CA9402 | |
| CDK2抗体 | CST | CA2546 | |
| CDK4抗体 | CST | CA12790 | |
| Wnt3a抗体 | CST | CA2721 | |
| Wnt5a/b抗体 | CST | CA2530 | |
| β-Catenin抗体 | CST | CA8480 | |
| Phospho-β-Catenin (Ser33/37/Thr41)抗体 | CST | CA9561 | |
| TCF1/TCF7抗体 | CST | CA2203 | |
| LEF1抗体 | CST | C12A5, CA2230 | |
| Bid抗体 | CST | CA2002 | |
| p21 Waf1/Cip1抗体 | CST | CA2947 | |
| HDAC1抗体 | CST | CA5356 | |
| HDAC2抗体 | CST | CA5113 | |
| HDAC3抗体 | CST | CA3949 | |
| 抗兔IgG二抗 | CST | CA7074 | |
| 抗小鼠IgG二抗 | CST | CA7076 | |
| HDAC10抗体 | Abcam | ab108934 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | CA60004-1-Ig | |
| 动物实验 | NOD/SCID小鼠 | Xiamen University Laboratory Animal Center | -- |
| 组织学与免疫组化 | Cleaved caspase-3抗体（免疫组化用） | CST | CA9664 |
| Ki-67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| DAB显色试剂 | MXB Biotechnologies | DAB-2032 | |
| Zeiss AxioScan7数字切片扫描仪 | Zeiss | -- | |
| 原代样本处理 | 70目细胞筛 | Biosharp | #BS-70-XBS |
| Ficoll-Hypaque密度梯度离心液 | Cytiva | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基、血清浓度、抗生素浓度、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and methods: Cell lines and chemicals |
| 药物处理 | 药物浓度梯度、处理时间、溶剂（DMSO）浓度 阅读提示：Materials and methods: Cell lines and chemicals 及补充表S1 |
| 增殖抑制实验 | 细胞数、处理时间（72小时）、检测方法（CCK-8） 阅读提示：Results: Venetoclax potentiated the inhibitory effects... 及Figure 2图注 |
| 凋亡实验 | 处理时间（24小时）、凋亡检测试剂（Annexin V/PI）、流式细胞仪设置 阅读提示：Results: Chidamide and venetoclax induced apoptosis... 及Figure 3图注 |
| 细胞周期实验 | 处理时间（48小时）、PI染色步骤、流式细胞仪设置 阅读提示：Results: The combined treatment induces... 及Figure 7图注 |
| 线粒体膜电位检测 | 处理时间（48小时）、JC-1探针浓度、孵育时间（30分钟） 阅读提示：Results: The mitochondrial membrane potential... 及Figure 6图注 |
| Western blot | 抗体稀释比例（文中未明确）、蛋白提取方法（未明确）、上样量（未明确） 阅读提示：Materials and methods: Immunoblotting analysis |
| RNA-seq | 细胞处理浓度（venetoclax 60 nM, chidamide 2 μM）、时间（24小时）、测序平台（未明确） 阅读提示：Materials and methods: RNA sequencing (RNA-seq) analysis |
| 动物实验 | 小鼠品系（NOD/SCID）、周龄（6周龄）、性别（雌性）、接种细胞数（未明确）、给药剂量（5 mg/kg/d chidamide, 10 mg/kg/d venetoclax）、给药途径（灌胃）、给药频率（每日） 阅读提示：Materials and methods: In vivo therapeutic efficacy 及Figure 11图注 |
| 免疫组化 | 一抗（cleaved caspase-3, Ki-67）、二抗（未明确）、DAB显色条件 阅读提示：Materials and methods: Histology and immunohistochemistry |
| 原代样本实验 | 样本类型（淋巴瘤淋巴结样本15例，健康供体外周血7例）、分离方法（Ficoll梯度离心）、处理时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods: Acquisition of primary samples 及Figure 13图注 |