建立糖尿病小鼠模型并验证卵巢表型
构建1型糖尿病小鼠模型并确认糖尿病对卵巢的宏观影响。
对10周龄雌性C57BL/6小鼠注射STZ（230 mg/kg）或对照缓冲液，30天后测量空腹血糖，通过HE染色评估卵巢形态和卵泡数量，监测动情周期。
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卵巢细胞和分子对糖尿病反应的多组学图谱
Multi-omics atlas of ovarian cellular and molecular responses to diabetes.
实验完整度
高包含体内疾病模型、单细胞转录组、DNA甲基化、代谢组学、免疫荧光和伪时间分析等多层次验证。
主要模型
C57BL/6小鼠糖尿病模型（STZ诱导） 原代卵巢细胞（颗粒细胞、黄体细胞、卵母细胞等）
重点核对
糖尿病诱导：单次高剂量链脲佐菌素（STZ）230 mg/kg 腹腔注射 糖尿病判定：空腹血糖≥17 mM scRNA-seq：每样本约8000个细胞加载，预期回收约6000个细胞 DNA甲基化：RRBS，CpG位点覆盖≥5× 代谢组学：LC-MS/MS，正负离子模式
摘要
糖尿病与生殖健康受损相关，但其影响卵巢功能的细胞和分子机制在很大程度上仍不清楚。在这项研究中，我们整合了单细胞RNA测序、DNA甲基化谱分析和代谢组学分析，全面表征了糖尿病雌性小鼠的卵巢细胞景观、表观遗传改变和代谢重编程，重点关注识别糖尿病诱导的卵巢细胞变化。我们的细胞类型特异性转录组分析揭示，类固醇激素生物合成失调和脂肪酸代谢受损是糖尿病卵巢功能障碍的显著特征。值得注意的是，包括Cyp11a1、Fshr和Lhcgr在内的关键基因在糖尿病条件下颗粒细胞中表现出表达降低，同时其基因区域的DNA甲基化水平升高。此外，颗粒细胞分化受到明显干扰，导致黄体细胞形成异常和黄体功能受损。同时，代谢组学分析揭示了糖尿病卵巢中深刻的代谢重编程，脂质代谢途径发生显著改变，包括不饱和脂肪酸升高和甘油磷脂代谢降低。总而言之，这些发现为糖尿病背景下卵巢功能障碍的分子途径提供了新的见解，从而增强了我们对代谢紊乱中卵泡形成的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 糖尿病如何通过细胞和分子机制影响卵巢功能？
- 核心机制
- 糖尿病通过增加Cyp11a1、Lhcgr等基因的DNA甲基化导致其表达下调，从而损害类固醇生成和脂肪酸代谢，并干扰颗粒细胞向黄体细胞的分化。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序显示Cyp11a1、Fshr、Lhcgr表达降低；RRBS显示相关基因启动子甲基化增加；伪时间分析揭示颗粒细胞分化轨迹受损；代谢组学显示脂质代谢重编程。
- 研究意义
- 为理解糖尿病相关卵巢功能障碍提供新机制见解，并为临床保护糖尿病女性生育力及识别新型诊断标志物和治疗靶点奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组图谱构建及细胞类型鉴定
绘制健康与糖尿病卵巢的单细胞转录组图谱并鉴定细胞类型。
使用10x Genomics平台对卵巢单细胞悬液进行scRNA-seq测序，鉴定14种卵巢细胞类型，并进行差异表达基因和GO富集分析。
细胞间通讯分析
探究糖尿病对卵巢细胞间通讯的影响。
利用CellChat推断细胞间配体-受体相互作用，比较T1DC和T1DM组之间的通讯强度和数量。
整合转录组和DNA甲基化分析
研究糖尿病对卵泡细胞基因表达和DNA甲基化的影响。
对卵母细胞进行Smart-seq2测序、对颗粒细胞进行RRBS测序，并整合分析关键基因的表达和甲基化变化。
颗粒细胞分化轨迹分析
评估糖尿病对颗粒细胞向黄体细胞分化过程的影响。
使用Monocle2进行伪时间分析，构建颗粒细胞和黄体细胞的分化轨迹，比较正常和糖尿病条件下的差异。
转录因子调控网络分析
分析糖尿病对颗粒细胞和黄体细胞转录因子调控网络的影响。
使用SCENIC推断转录因子调控网络，比较T1DC和T1DM组间差异，并分析关键转录因子在伪时间轨迹上的表达。
代谢组学分析
表征糖尿病卵巢的全局代谢改变。
对卵巢组织进行LC-MS/MS代谢组学分析，鉴定差异表达代谢物并进行通路富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| scRNA-seq文库构建 | 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
| Chromium单细胞3'文库与凝胶微珠试剂盒v3 | 10x Genomics | -- | |
| DNA甲基化测序 | 口腔拭子基因组DNA提取试剂盒 | Tiangen | DP322-03 |
| MethylCode亚硫酸盐转化试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| QIAquick凝胶提取试剂盒 | Qiagen | -- | |
| HE染色 | Harris苏木素溶液 | Sigma-Aldrich | -- |
| 伊红Y溶液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫荧光 | 抗Hsd3b1抗体 | Santa Cruz | sc-515120 |
| 抗Cyp11a1抗体 | Signalway | 32398 | |
| 抗Lhcgr抗体 | Biorbyt | orb13542 | |
| DAPI | Life Technologies | -- | |
| 代谢组学分析 | ExionLC超高效液相色谱系统 | SCIEX | -- |
| TripleTOF 5600质谱仪 | SCIEX | -- | |
| Waters HSS T3色谱柱 | Waters | -- | |
| scRNA-seq仪器 | Chromium控制器 | 10x Genomics | -- |
| 测序平台 | Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、年龄、STZ剂量、给药方式、糖尿病判定标准、饲养环境 阅读提示：Methods 2.1, 2.2节 |
| scRNA-seq | 卵巢解离、细胞浓度、目标细胞数、文库试剂盒、测序平台 阅读提示：Methods 2.3节 |
| DNA甲基化 | 颗粒细胞收集、DNA提取试剂盒、亚硫酸盐转化、PCR条件、测序平台 阅读提示：Methods 2.9节 |
| 代谢组学 | 样品制备、提取溶剂、LC-MS/MS参数、色谱柱、质谱条件 阅读提示：Methods 2.10, 2.11节 |
| 免疫荧光 | 抗体及其稀释比例、抗原修复条件、切片厚度 阅读提示：Methods 2.13节 |