GP2纤丝提取与纯化
从人胰腺组织中提取天然GP2纤丝用于结构解析和功能研究。
从手术切除的人胰腺组织（供体1）中提取GP2纤丝，经匀浆、差速离心和DNase/RNase处理，获得富含GP2纤丝的样品，并通过负染电镜验证纤丝存在。
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人糖蛋白2的结构揭示消化道的纤丝形成机制和对蛋白水解环境的适应
Structure of human glycoprotein 2 reveals mechanisms underlying filament formation and adaption to proteolytic environment in the digestive tract.
实验完整度
高包含基于人组织样本的冷冻电镜结构解析、Western blot蛋白水解分析、质谱糖基化鉴定以及FimH结合和细菌聚集功能验证等多个独立实验层级。
主要模型
人胰腺组织来源的GP2纤丝 人小肠组织样本（供体2-4） 大肠杆菌TOP10细胞
重点核对
人胰腺GP2纤丝提取及冷冻电镜结构（3.5 Å分辨率） 弹性蛋白酶处理浓度0.5 mg/ml，37°C孵育20小时 FimH结合实验使用终浓度0.4 mg/ml的FITC-FimHL，25°C孵育24小时 Western blot使用抗GP2(35-179)和抗GP2(111-387)抗体 N-糖基化分析使用LC-MS/MS，鉴定到Asn291和Asn342的高甘露糖修饰
摘要
糖蛋白2（GP2）和尿调节素（UMOD）被认为是直系同源物，具有高度序列相似性和相似的抗菌功能。UMOD在泌尿道中作为纤丝大量存在，其N端区域暴露于纤丝核心外（称为分支）的一个高甘露糖N-糖基化位点作为粘附拮抗剂对抗致病菌感染。UMOD的抗菌功能可被蛋白酶消除，因为其分支易受蛋白水解活性影响。GP2在胰腺中表达并分泌到消化道中。GP2是否以纤丝形式执行功能以及它如何在富含蛋白酶的消化道中保持功能性尚不清楚。在本研究中，我们从手术切除的人胰腺中提取了GP2纤丝并确定了它们的冷冻电镜结构。我们的结构分析揭示GP2通过其ZP模块形成纤丝，该模块由ZPN和ZPC结构域以及连接这两个结构域的接头组成。GP2的N端区域（分支）不构成纤丝核心，在冷冻电镜结构中显得灵活。我们的生化实验表明，尽管GP2的分支也易受蛋白酶影响，但在耐蛋白酶的GP2纤丝核心上鉴定到了额外的高甘露糖N-聚糖。因此，无分支的GP2纤丝保留了与细菌粘附素FimH的结合能力，确保GP2的抗菌功能在蛋白水解环境中不受影响。我们的研究首次提供了GP2纤丝形成的实验证据，并揭示了GP2适应于与UMOD不同环境的分子机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GP2是否形成纤丝，以及它如何在富含蛋白酶的消化道中维持抗菌功能？
- 核心机制
- GP2纤丝核心上的高甘露糖N-糖基化位点（Asn291和Asn342）作为FimH粘附的受体，使无分支的纤丝核心仍能结合FimH并诱导细菌聚集，从而适应蛋白水解环境。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构解析揭示GP2纤丝结构；弹性蛋白酶切割实验显示分支被切除而核心保持完整；LC-MS/MS鉴定到核心上的高甘露糖位点；FimH结合实验和细菌聚集实验证实无分支纤丝仍具功能。
- 研究意义
- 首次提供GP2纤丝形成的实验证据，揭示了GP2与UMOD环境适应差异的分子机制，为理解ZP模块蛋白在不同生理环境中的功能演化提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜结构解析
确定GP2纤丝的原子结构，揭示其组装机制和N-糖基化位点。
使用冷冻电镜单颗粒分析对GP2纤丝进行结构解析，获得3.5 Å分辨率的三维重构，并构建原子模型。
蛋白水解切割实验
检验GP2纤丝的分支是否易被蛋白酶切割以及核心是否耐蛋白水解。
将GP2纤丝与弹性蛋白酶孵育，通过Western blot和负染电镜分析切割前后样品，发现分支被完全切割，而核心保持完整。
N-糖基化位点鉴定
鉴定GP2纤丝上的N-糖基化位点和聚糖类型，特别是高甘露糖类型。
使用LC-MS/MS对胰腺来源的GP2进行N-糖基化分析，鉴定到9个N-糖基化位点，其中Asn291和Asn342为高甘露糖类型并位于纤丝核心。
FimH结合功能验证
验证GP2和eGP2纤丝是否保留结合细菌粘附素FimH的能力。
通过FITC标记的FimH结合试验和免疫金标记电镜，检测GP2和eGP2纤丝与FimH的结合能力，并通过细菌聚集实验验证功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| GP2提取 | 脱氧核糖核酸酶I | TIANGEN | -- |
| 核糖核酸酶A | Beyotime | -- | |
| 负染电镜 | 醋酸铀 | -- | -- |
| 碳膜铜网 | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co. | -- | |
| Talos L120C G2透射电子显微镜 | Thermofisher | -- | |
| 冷冻电镜 | Quantifoil 1.2/1.3 200目载网 | -- | -- |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Titan Krios透射电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| K2直接检测相机 | -- | BioQuantum | |
| Western blot | Bis-Tris预制胶 | GenScript | M00928 |
| PVDF膜 | Merk | -- | |
| 脱脂牛奶 | Sangon Biotech | -- | |
| 抗GP2 (111-387)多克隆抗体 | Signalway Antibody | 30715 | |
| 抗GP2 (35-179)单克隆抗体 | Novus | NBP2-53322 | |
| NCM通用抗体稀释液 | NCM | WB500D | |
| 抗兔IgG HRP | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| 抗鼠IgG HRP | Cell Signaling Technology | 96714S | |
| ECL化学发光底物 | Tanon | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| RNA提取 | SteadyPure通用RNA提取试剂盒 | Accurate Biology | -- |
| cDNA合成 | HiScript III第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | -- |
| 克隆 | pCE2 TA/Blunt-Zero载体 | Vazyme | -- |
| 5分钟TA/Blunt-Zero克隆试剂盒 | Vazyme | -- | |
| SDS-PAGE | eStain蛋白染色设备 | GenScript | -- |
| 蛋白水解 | 弹性蛋白酶 | Bioss | D13054 |
| 蛋白表达 | pET28a表达质粒 | -- | -- |
| 大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞 | Yeasen | 11804ES80 | |
| 异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| FimH结合实验 | 异硫氰酸荧光素 | Adamas | -- |
| Amicon ultra-15离心过滤器 | Millipore | -- | |
| Amicon ultra-0.5离心过滤器 | Millipore | -- | |
| 免疫金标记 | FimH抗体 | Cusabio Technology | CSB-PA362,349ZA01ENV |
| 6纳米胶体金亲和纯化驴抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | -- | |
| 细菌聚集 | 大肠杆菌TOP10感受态细胞 | Yeasen | 11801ES80 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GP2纤丝提取 | 人胰腺组织来源（供体1），匀浆缓冲液组成，离心速度和时间，sarkosyl浓度，DNase/RNase处理 阅读提示：Methods, GP2 extraction |
| 冷冻电镜结构解析 | Titan Krios 300 kV，K2相机，总剂量40 e-/Å2，像素大小1.05 Å，颗粒数249,718，分辨率3.5 Å 阅读提示：Methods, Cryo-EM data collection and processing; Table 1 |
| 蛋白水解切割实验 | 弹性蛋白酶浓度0.5 mg/ml，37°C孵育20小时，GP2样品浓度1 mg/ml（总蛋白） 阅读提示：Methods, Proteolytic cleavage assays |
| N-糖基化分析 | LC-MS/MS仪器设置，蛋白酶消化（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶），数据搜索参数（PEAKS GlycanFinder，FDR 0.05） 阅读提示：Methods, N-glycosylation analysis with liquid chromatography-tandem mass spectrometry |
| FimH结合功能验证 | FITC-FimHL浓度0.4 mg/ml，GP2样品与FITC-FimHL体积比4:1，25°C孵育24小时，100 kDa截留离心过滤 阅读提示：Methods, FimHL binding assay |