RNA修饰丰度检测
检测甲藻和哺乳动物细胞中多种RNA修饰的丰度，确定m1A在mRNA中的存在和水平。
提取A. carterae和HEK293T的总RNA和mRNA，使用LC-MS/MS定量m1A、m6A等修饰，并进行dot blot验证。
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甲藻中丰富的mRNA m1A修饰：基因调控的新层面
Abundant mRNA m1A modification in dinoflagellates: a new layer of gene regulation.
实验完整度
高包含LC-MS/MS定量、MeRIP-seq、m1A-seq-TGIRT、Ribo-seq、体外酶活实验、氮耗竭处理及生物信息学分析等多层次验证。
主要模型
甲藻Amphidinium carterae HEK293T细胞系 甲藻Symbiodinium sp.和Crypthecodinium cohnii 绿藻Chlamydomonas reinhardtii
重点核对
m1A水平通过LC-MS/MS定量，m1A占总腺嘌呤的3.05%（A. carterae mRNA） m1A-seq-TGIRT鉴定6549个m1A位点，主要位于3'UTR（81.4%） Ribo-seq分析翻译效率，m1A修饰的转录本翻译效率降低 氮耗竭条件下m1A水平降至正常条件的约67% 体外酶活实验显示AcTRMT6/AcTRMT61A不催化mRNA m1A形成
摘要
甲藻是一类单细胞真核浮游植物，表现出极少的转录调控，代表了探索基因表达的一种独特模型。由于mRNA N1-甲基腺苷（m1A）在典型真核mRNA中含量有限，其生物合成、分布、调控和功能仍存在争议。本研究提供了甲藻mRNA中m1A的全面图谱，并表明在不同甲藻物种中，m1A而非N6-甲基腺苷（m6A）是主要的内部mRNA修饰，且在成熟转录本上呈不对称分布。在Amphidinium carterae中，我们鉴定了6549个m1A位点，其特征是非tRNA T环样序列基序，位于3196个基因的转录本中，其中许多基因参与调控碳和氮代谢。甲藻mRNA m1A富集于3'UTR，其水平与翻译效率负相关。氮耗竭进一步降低mRNA m1A水平。我们的数据表明，m1A修饰的独特模式可能通过翻译控制影响代谢相关基因的表达。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 甲藻mRNA中m1A修饰的分布、丰度及其在基因表达调控中的功能是什么？
- 核心机制
- m1A修饰通过降低翻译效率抑制mRNA翻译，且在氮耗竭时动态变化，m1A水平与翻译效率负相关，其作用依赖于转录本区域。
- 主要证据
- LC-MS/MS显示m1A在A. carterae mRNA中占比3.05%，m1A-seq-TGIRT和MeRIP-seq揭示m1A主要位于3'UTR，Ribo-seq分析表明m1A修饰的转录本翻译效率降低，氮耗竭导致m1A水平下降。
- 研究意义
- 揭示了m1A作为甲藻mRNA中主要的内部修饰，在翻译水平调控基因表达，可能是甲藻应对环境胁迫（如氮耗竭）的一种策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组水平m1A图谱构建
鉴定A. carterae中m1A位点，分析其分布特征和序列基序。
使用MeRIP-seq和m1A-seq-TGIRT方法进行m1A位点鉴定，并进行motif分析、区域分布统计。
m1A与翻译效率关联分析
探究m1A修饰对mRNA翻译效率的影响。
进行RNA-seq和Ribo-seq，计算翻译效率，比较m1A修饰与非修饰转录本的翻译效率。
氮耗竭下m1A动态变化
研究氮耗竭对m1A水平和分布的影响及其对翻译的调控。
在氮耗竭条件下培养A. carterae，测量m1A水平变化，进行MeRIP-seq和Ribo-seq分析差异甲基化区域和翻译效率。
m1A甲基转移酶活性验证
验证候选甲基转移酶AcTRMT6/AcTRMT61A是否负责mRNA m1A形成。
克隆表达AcTRMT6/AcTRMT61A复合物，用体外生化实验检测其对不同RNA底物的甲基转移酶活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 甲藻Amphidinium carterae | Shanghai Guangyu Biotechnology Co., Ltd. | GY-H35 |
| 甲藻Symbiodinium sp. | Shanghai Guangyu Biotechnology Co., Ltd. | GY-H50 | |
| 甲藻Crypthecodinium cohnii | ATCC | 30556 | |
| HEK293T细胞 | -- | -- | |
| 蛋白表达 | 大肠杆菌BL21 (DE3) | AlpalifeBio | Cat #KTSM104L |
| pETDuet-1载体 | Sigma-Aldrich | Cat #71146-3CN | |
| 抗体 | 小鼠抗1-甲基腺苷(m1A)单克隆抗体 | MBL | Cat #D345-3 |
| 山羊抗小鼠IgG (H&L) HRP | Signalway Antibody | Cat #L35007 | |
| RNA建库 | VAHTS RNA接头套装1-2（Illumina） | Vazyme, Nanjing, China | Cat #N803 |
| VAHTS小RNA Index引物试剂盒（Illumina） | Vazyme, Nanjing, China | Cat #N816 | |
| RNA消化 | 蛋白酶K | NEB | Cat #P8107S |
| 核酸酶P1 | NEB | Cat #M0660S | |
| 南极磷酸酶 | NEB | Cat #M0289S | |
| RNA连接 | T4多核苷酸激酶 | NEB | Cat #M0201S |
| T4 RNA连接酶1 | NEB | Cat #M0204S | |
| 免疫沉淀 | Pierce蛋白A/G磁珠 | ThermoFisher | Cat #88803 |
| RNA片段化 | RNA片段化试剂 | Invitrogen | Cat #AM8740 |
| 核糖体分析 | 核糖核酸酶I | Invitrogen | Cat #EN0601 |
| RNA提取 | VAHTS mRNA捕获磁珠 | Vazyme, Nanjing, China | Cat #N401-01 |
| RNAzol®RT | MRC | Cat #RN190 | |
| 免疫沉淀 | 无EDTA蛋白酶抑制剂 | Roche Diagnostics | Cat #04693132001 |
| RNA提取 | RNaseOff™ RNase抑制剂 | Cwbio, Beijing, China | Cat #CW3335S |
| Triquick RNA提取试剂 | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd, China | Cat #AC13984 | |
| RNA纯化 | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | Cat #A63880 |
| 逆转录 | TGIRT-III逆转录酶 | HaiGene Biotech Co.,Ltd, China | Cat #D0310 |
| 蛋白纯化 | Ni NTA磁珠6FF | Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co., Ltd., China | Cat #SA005005 |
| Western blot | Clarity Western ECL底物 | BIO-RAD | Cat #1705061 |
| RNA纯化 | Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | Cat #D4060 |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | Cat #R1013 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research | Cat #R1017 | |
| ZR小RNA PAGE回收试剂盒 | Zymo Research | Cat #R1070 | |
| RNA定量 | Equalbit RNA HS检测试剂盒 | Vazyme, Nanjing, China | Cat #EQ211-01 |
| DNA定量 | Equalbit 1 × dsDNA HS检测试剂盒 | Vazyme, Nanjing, China | Cat #EQ121-02 |
| RNA文库构建 | VAHTS Universal V8 RNA-seq文库制备试剂盒（Illumina） | Vazyme, Nanjing, China | Cat #NR605-01 |
| VAHTS小RNA文库制备试剂盒（Illumina） | Vazyme, Nanjing, China | Cat #NR811-01 | |
| 细胞计数 | Countess TM II FL细胞计数仪 | ThermoFisher | -- |
| RNA定量 | Qubit荧光计 | ThermoFisher | -- |
| 测序 | Illumina Novaseq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| DNBSEQ-T7测序仪 | MGI Tech Co., Ltd., China | -- | |
| PromethION测序仪 | Oxford Nanopore Technologies | -- | |
| MGISEQ-2000RS测序仪 | MGI Tech Co., Ltd., China | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | A. carterae和Symbiodinium sp.培养条件：f/2培养基，23°C，12:12光暗周期，光通量密度50 µmol·m⁻²·s⁻¹；C. cohnii培养于A2E6培养基，暗条件；HEK293T细胞培养于DMEM+10% FBS+1%青霉素-链霉素，37°C，5% CO2。 阅读提示：Methods - Cell culture |
| RNA修饰定量 | LC-MS/MS检测m1A和m6A水平，使用nuclease P1和Antarctic Phosphatase消化RNA，检测条件。 阅读提示：Methods - RNA preparation for LC-MS/MS analysis |
| MeRIP-seq | 抗m1A抗体（MBL #D345-3）用量，IP缓冲液成分，洗涤条件，RNA片段化条件（70°C 10 min）。 阅读提示：Methods - MeRIP |
| m1A-seq-TGIRT | 抗体用量，TGIRT-III逆转录条件（57°C 2h），RNA连接和PCR条件。 阅读提示：Methods - m1A-seq-TGIRT |
| Ribo-seq | cycloheximide处理浓度（100 µg/ml）和时间（8 min），裂解缓冲液成分，RNase I用量（15 U/OD），RPF片段大小（25-34 nt）。 阅读提示：Methods - RNA-seq and Ribo-seq experiments |
| 氮耗竭实验 | A. carterae初始浓度2.5 × 10⁴ cells/ml，氮耗竭培养基，培养6天。 阅读提示：Methods - Cell culture |
| 体外酶活实验 | AcTRMT6/AcTRMT61A重组蛋白浓度（5 µM），d3-SAM浓度（32 µM），反应温度（28°C）和时间（过夜）。 阅读提示：Methods - Biochemical assay of AcTRMT6-AcTRMT61A heterocomplex activity in vitro |
| 生物信息学分析 | 参考基因组（Acart.genome.v1），比对软件STAR参数（RNA-seq和Ribo-seq最大错配2，m1A-seq-TGIRT为3），m1A位点筛选标准（覆盖度>10，错配率>10%，Z检验p<0.05）。 阅读提示：Methods - Bioinformatics analyses of RNA-seq, Ribo-seq, MeRIP-seq, and m1A-seq-TGIRT data |