评估DHAA对胃癌细胞和类器官活力的影响
验证DHAA是否具有抑制胃癌细胞和类器官活力的作用
使用CCK-8试剂检测HGC-27和MGC-803细胞在DHAA处理后的活力，计算IC50；使用CellTiter-Glo 3D试剂检测类器官活力，并观察形态变化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
脱氢枞胺通过影响胃癌中的核苷酸代谢发挥抗肿瘤作用
Dehydroabietylamine exerts antitumor effects by affecting nucleotide metabolism in gastric cancer.
实验完整度
高包含细胞活力、克隆形成、类器官、RNA测序、凋亡检测、Western blot、qRT-PCR、分子对接及转基因小鼠体内实验等多层级验证。
主要模型
胃癌细胞系HGC-27和MGC-803 胃癌类器官 K19-Wnt1/C2mE转基因小鼠
重点核对
DHAA浓度（0-10 μM）及处理时间（24 h）对细胞活力的影响 DHAA处理浓度4 μM对类器官形态和活力的影响 DHAA处理下关键酶CAD、DHODH、PAICS的mRNA和蛋白水平变化 FOXK2过表达对DHAA诱导凋亡的逆转作用 小鼠给药剂量（0.244 mg/只，约7.5 mg/kg）和频率（每周两次）对肿瘤生长的影响
摘要
核苷酸代谢是肿瘤（包括胃癌（GC））自我复制过程中最终且最关键的环节。然而，在临床治疗中，经典的抗肿瘤药物如5-氟尿嘧啶（5-FU）大多是嘌呤或嘧啶的代谢类似物，对肿瘤细胞缺乏特异性，因此具有显著的副作用。目前尚不清楚除了核酸类似物外，是否还有其他药物可以靶向核苷酸代谢。在这里，我们发现一种天然化合物脱氢枞胺（DHAA）能显著降低胃癌细胞和类器官的活力与增殖。DHAA破坏胃癌细胞的嘌呤和嘧啶代谢，导致DNA损伤并进一步诱导凋亡。DHAA处理降低了核苷酸代谢通路中关键酶的转录和蛋白水平，其中嘧啶代谢关键酶CAD、DHODH和嘌呤代谢关键酶PAICS的表达显著降低。我们还发现DHAA直接结合并降低Forkhead box K2（FOXK2）的表达，FOXK2是这些代谢酶的常见转录因子。最终，DHAA被证明能延迟K19-Wnt1/C2mE转基因小鼠模型的肿瘤发生，并降低体内CAD、DHODH和PAICS的水平。我们证明DHAA通过靶向转录因子FOXK2，减少核苷酸代谢关键基因的转录并损害核苷酸生物合成，从而对胃癌发挥抗癌作用，因此DHAA是胃癌治疗的有希望的候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DHAA是否能通过靶向核苷酸代谢抑制胃癌生长，其具体机制是什么？
- 核心机制
- DHAA直接结合转录因子FOXK2，降低其表达，进而减少核苷酸代谢关键酶CAD、DHODH和PAICS的转录，抑制核苷酸生物合成，导致DNA损伤和凋亡。
- 主要证据
- 细胞实验显示DHAA降低GC细胞和类器官活力、诱导凋亡；RNA测序显示核苷酸代谢通路下调；Western blot和qRT-PCR证实关键酶表达下降；FOXK2过表达逆转凋亡；转基因小鼠实验中DHAA抑制肿瘤生长并降低关键酶水平。
- 研究意义
- DHAA是一种类似5-FU的调节核苷酸代谢的药物，有潜力作为胃癌的治疗化合物，但需要进一步研究和多中心临床试验验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RNA测序分析DHAA对基因表达的影响
探索DHAA影响胃癌细胞和类器官的潜在分子通路
HGC-27细胞和类器官经DHAA处理后提取RNA，进行测序，并进行KEGG和GO富集分析。
验证核苷酸代谢关键酶的表达变化
确认DHAA是否影响核苷酸代谢通路中关键酶的转录和蛋白水平
使用qRT-PCR检测多种核苷酸代谢酶的mRNA水平，使用Western blot检测蛋白水平。
检测DHAA对细胞凋亡和细胞周期的影响
验证DHAA是否诱导凋亡和影响细胞周期
使用Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术检测凋亡率，使用PI染色检测细胞周期分布。
验证FOXK2在DHAA作用中的功能
确定DHAA是否通过FOXK2调控核苷酸代谢酶的表达并介导凋亡
构建FOXK2过表达质粒，转染GC细胞，通过qRT-PCR和Western blot检测CAD、DHODH、PAICS表达，并通过流式检测凋亡。
体外验证DHAA与FOXK2的直接结合
验证DHAA是否直接与FOXK2蛋白结合
使用AlphaFold2预测FOXK2结构，通过分子对接分析DHAA与FOXK2的结合。
体内评估DHAA的抗肿瘤效果
验证DHAA在体内是否抑制胃癌肿瘤生长并影响核苷酸代谢
使用K19-Wnt1/C2mE转基因小鼠，腹腔注射DHAA或对照，观察肿瘤体积，并进行组织学分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 脱氢枞胺 | Bidepharm | BD123672 |
| 二甲亚砜 | Sigma | -- | |
| 类器官培养 | 高级DMEM F12培养基 | Gibco | -- |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 胃癌类器官培养基 | Five Elements Bio-Technology | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8检测试剂盒 | APExBIO | -- |
| 类器官活力检测 | CellTiter-Glo 3D试剂 | Promega | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | TransGen Biotech | -- |
| RNA-seq | Illumina HiSeq-2500测序仪 | Illumina | -- |
| qRT-PCR | cDNA合成预混试剂盒 | TransGen Biotech | -- |
| TransStart Top/Tip Green qPCR预混液 | TransGen Biotech | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| 抗CAD抗体 | Cell Signaling Technology | 11933 | |
| 抗IMPDH2抗体 | Cell Signaling Technology | 36281 | |
| 抗GMPS抗体 | Cell Signaling Technology | 14602 | |
| 抗DYKDDDDK抗体 | Cell Signaling Technology | 8146 | |
| 抗c-Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 5605 | |
| 抗p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗MITF抗体 | Cell Signaling Technology | 12590 | |
| 抗ATF4抗体 | Cell Signaling Technology | 11815 | |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 抗DHODH抗体 | ABclonal | A13295 | |
| 抗UMPS抗体 | ABclonal | A13251 | |
| 抗PPAT抗体 | ABclonal | A6698 | |
| 抗GART抗体 | ABclonal | A3876 | |
| 抗PFAS抗体 | ABclonal | A17517 | |
| 抗PAICS抗体 | ABclonal | A6450 | |
| 抗ADSL抗体 | ABclonal | A6278 | |
| 抗ATIC抗体 | ABclonal | A5559 | |
| 抗ADSS1抗体 | ABclonal | A0178 | |
| 抗ADSS2抗体 | ABclonal | A12398 | |
| 抗APRT抗体 | ABclonal | A5456 | |
| 抗SP1抗体 | ABclonal | A14662 | |
| 抗E2F1抗体 | ABclonal | A16720 | |
| 抗FOXK2抗体 | ABclonal | A14245 | |
| 抗IMPDH1抗体 | ABclonal | A16899 | |
| 抗兔二抗 | Abcam | ab150077 | |
| 抗鼠二抗 | Bio-Rad | 1706516 | |
| 凋亡检测 | Annexin V FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Yeasen | -- |
| CytoFLEX S流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 细胞增殖检测 | BeyoClick EdU细胞增殖检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| PI/RNase染色缓冲液 | BD Biosciences | -- | |
| 质粒构建 | pCMV-C-3xFlag表达载体 | Public Protein/Plasmid Library | -- |
| 动物实验 | 聚氧乙烯蓖麻油 | -- | -- |
| 组织学分析 | 抗原修复液 | Maxim | DIG-3009 |
| 超敏S-P免疫组化试剂盒 | Maxim | KIT-9730 | |
| 增强型DAB显色试剂盒 | Maxim | DAB-2032 | |
| 抗cleaved PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 5625 | |
| 抗CK8抗体 | Abcam | ab53280 | |
| 抗PCNA抗体 | Abcam | ab18197 | |
| 抗Ki67抗体 | Signalway Antibody | 48871 | |
| 抗p53抗体 | Santa Cruz Biotechnology | F2117 | |
| 分子对接 | Maestro 11.1软件 | Schrödinger | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力检测 | 细胞株（HGC-27、MGC-803）来源，DHAA浓度（0-10 μM），处理时间（24 h），细胞接种密度（5×10^3细胞/孔） 阅读提示：Methods: Cell lines, culture conditions, and reagents; Measurement of cell and organoid viability；Figure 1A |
| 类器官培养与活力检测 | 肿瘤组织来源，消化方法，Matrigel用量，类器官培养基成分，DHAA浓度（4 μM），观察时间点（0, 24, 48, 72 h） 阅读提示：Methods: Organoid culture; Measurement of cell and organoid viability；Supplementary Figure 1B |
| RNA测序 | 细胞处理（4 μM DHAA，24 h），RNA提取方法，测序平台（Illumina HiSeq-2500），差异表达基因筛选标准（adjusted P<0.05） 阅读提示：Methods: RNA sequencing；Figure 2A |
| qRT-PCR | 内参基因（β-actin），引物序列，反应体系和程序，重复次数（三次） 阅读提示：Methods: RNA extraction and qRT-PCR；Figure 4A |
| Western blot | 裂解液成分，抗体浓度（1:1000），孵育条件，内参（β-actin） 阅读提示：Methods: Western blot analysis；Figure 4B |
| 凋亡检测 | 细胞处理（4 μM DHAA，24 h），Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞仪分析 阅读提示：Methods: Apoptosis assay；Figure 3C |
| 细胞周期检测 | 细胞处理（4 μM DHAA，24 h），EdU标记，PI染色 阅读提示：Methods: EdU incorporation assay；Figure 3D |
| 质粒构建与过表达 | 表达载体（pCMV-C-3xFlag），限制性酶切位点（EcoRI/XhoI），转染方法 阅读提示：Methods: Plasmid construction；Figure 5B |
| 分子对接 | FOXK2蛋白结构来源（AlphaFold），软件（Maestro 11.1），结合能（-7.5 kcal/mol） 阅读提示：Methods: Molecular docking；Supplementary Figure 2E-G |
| 动物实验 | 小鼠品系（K19-Wnt1/C2mE），周龄（28周），给药剂量（0.244 mg/只，约7.5 mg/kg），频率（每周两次），持续时间（4周），对照组（vehicle） 阅读提示：Methods: In vivo experiments；Figure 6A |
| 组织学分析 | 组织固定方法（4%多聚甲醛），切片厚度（4 μm），抗原修复，抗体浓度（如anti-CAD 1:800），显色系统（DAB） 阅读提示：Methods: Histological analysis；Figure 6C |