鉴定TRIM25为抗病毒SG标志物
通过蛋白质组学方法鉴定应激颗粒中的病毒特异性成分
利用BioID邻近标记结合定量质谱技术，分析poly(I:C)刺激后的G3BP1相互作用网络。
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TRIM25主要与抗病毒应激颗粒相关
TRIM25 predominately associates with anti-viral stress granules.
实验完整度
高综合运用了细胞实验、体外LLPS实验、蛋白互作实验、泛素化检测、信号通路分析、病毒感染实验等多个证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HeLa细胞 HEK293T细胞 U2OS细胞 G3BP dKO U2OS细胞 TRIM25 KO HEK293T细胞
重点核对
TRIM25与G3BP1的共定位特异性依赖于poly(I:C)或SeV处理 TRIM25与G3BP1共凝聚需要PTFG基序 G3BP1与TRIM25的相互作用及G3BP1二聚化对增强TRIM25泛素化活性至关重要 TRIM25-G3BP1共凝聚对激活RIG-I信号通路及抑制SeV复制至关重要
摘要
应激颗粒（SGs）由各种环境应激源诱导产生，导致其组成和功能的异质性。SGs因其强大的翻译抑制作用和触发信号转导的能力，在抗病毒过程中发挥着至关重要的作用；然而，关于这些抗病毒SGs与其他环境应激源诱导的SGs有何不同，目前尚不清楚。在这里，我们确定TRIM25（一种已知的泛素化依赖性抗病毒先天免疫反应的驱动因子）是抗病毒SGs的有效且关键的标志物。TRIM25经历液-液相分离（LLPS），并以dsRNA依赖性方式与SG核心蛋白G3BP1共凝聚。TRIM25与G3BP1的共凝聚显著增强了TRIM25对多种主要位于SGs中的抗病毒蛋白的泛素化活性。这种共凝聚对于激活RIG-I信号通路从而抑制RNA病毒感染至关重要。我们的研究为更好地理解应激颗粒成分的异质性及其对不同环境应激源的反应提供了一个概念框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 抗病毒应激颗粒与其他应激颗粒在组成和功能上有何不同？TRIM25在其中扮演什么角色？
- 核心机制
- TRIM25与核心蛋白G3BP1在dsRNA存在下发生共凝聚，形成抗病毒应激颗粒。该共凝聚增强TRIM25对多种底物（如RIG-I、ZC3HAV1、IGF2BP2）的泛素化活性，从而激活RIG-I信号通路并抑制RNA病毒感染。
- 主要证据
- 通过BioID邻近标记、免疫荧光共定位、体外LLPS实验、FRAP、泛素化测定、qPCR及病毒复制实验证实。
- 研究意义
- 本研究为理解应激颗粒的异质性及其在不同应激条件下的功能提供了框架，并可能为开发针对应激相关疾病的靶向治疗提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证TRIM25与G3BP1的共定位和共凝聚
验证TRIM25是否与G3BP1共定位及是否通过LLPS形成共凝聚体
通过免疫荧光共定位、FRAP实验和体外LLPS实验验证TRIM25与G3BP1的相互作用及液-液相分离特性。
验证TRIM25-G3BP1共凝聚对泛素化活性的影响
检测TRIM25-G3BP1共凝聚是否增强TRIM25对底物的泛素化
通过细胞泛素化实验和体外泛素化实验评估TRIM25-G3BP1共凝聚对底物泛素化水平的影响。
验证TRIM25-G3BP1共凝聚对RIG-I信号通路和病毒复制的影响
验证TRIM25-G3BP1共凝聚是否激活RIG-I信号通路并抑制病毒复制
检测TRIM25-G3BP1共凝聚对IRF3磷酸化、干扰素及干扰素刺激基因表达的影响，并检测对SeV复制的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Hieff TransTM脂质体转染试剂 | Yeasen | 40802ES03 |
| 药物处理 | Poly(I:C) LMW | InvivoGen | tlrl-picw-250 |
| CCCP | Selleck | S6494 | |
| 毒胡萝卜素 | TargetMol | TQ0302 | |
| 嘌呤霉素 | Sangon | A610593-0026 | |
| MG132 | TargetMol | T2154 | |
| 山梨醇 | TargetMol | T0332 | |
| Western blot | G3BP1抗体 | Proteintech | 66486-1-lg |
| G3BP2抗体 | Proteintech | 16276-1-AP | |
| TRIM25抗体 | Proteintech | 12573-1-AP | |
| IRF3抗体 | Proteintech | 11312-1-AP | |
| IGF2BP2抗体 | Proteintech | 11601-1-AP | |
| ZC3HAV1抗体 | Proteintech | 66413-1-lg | |
| RIG-I抗体 | Proteintech | 67556-1-lg | |
| GFP抗体 | Proteintech | 50430-2-AP | |
| mCherry抗体 | Proteintech | 26765-1-AP | |
| HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Flag抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| ZCCHC3抗体 | ABclonal | A17235 | |
| 泛素抗体 | GeneTex | GT7811 | |
| 磷酸化IRF3 (Ser396)抗体 | Abbkine | ABP54922 | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Signalway Antibody | L3012 | |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP | Signalway Antibody | L3032 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔IgG (H+L) 交叉吸附二抗, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher | A-11010 |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L) 交叉吸附二抗, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher | A-11003 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L) 交叉吸附二抗, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11001 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L) 交叉吸附二抗, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11008 | |
| 细胞核染色 | DAPI | Servicebio | CR2110134 |
| Hoechst | Yeasen | 40732ES03 | |
| 蛋白纯化 | 直链淀粉树脂 | NEB | -- |
| Ni-NTA柱 | Qiagen | -- | |
| Superdex 200 Increase 10/300 | GE Healthcare | -- | |
| RT-qPCR | Easy Pure® RNA提取试剂盒 | TransGen | -- |
| TransScript第一链cDNA合成Super Mix | TransGen | -- | |
| SYBR Green Master | Roche | -- | |
| 蛋白表达 | pFastBac载体 | Thermo Fisher | -- |
| pET28a载体 | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | Oregon-Green488 | Invitrogen | 2161802 |
| Cy3 | Lumiprobe | #41070 | |
| 等温滴定量热法 | Microcal iTC200 | -- | -- |
| RNA制备 | 14-mer RNA寡核苷酸 | Sangon BioTech | -- |
| 28-mer RNA寡核苷酸 | Sangon BioTech | -- | |
| 56-mer RNA寡核苷酸 | Sangon BioTech | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系（HeLa, HEK293T, U2OS等）来源，培养基成分（DMEM, 10%FBS, 100U/ml青霉素, 100U/ml链霉素），培养条件（37°C, 5% CO2），各种应激物处理浓度和时间（poly(I:C) 2μg/ml 6-10h, SeV MOI=0.1 12h, 亚砷酸钠 2mM 0.5h, 毒胡萝卜素 10μM 1h, 嘌呤霉素 20μg/ml 3h, MG132 10μM 3h, CCCP 20μM 在无糖培养基中1h）。 阅读提示：Methods: Cell culture and transfection, Immunofluorescence microscopy and live-cell imaging |
| 质粒转染 | 转染试剂（Hieff TransTM Liposomal Transfection Reagent）及使用浓度，细胞密度（约80%汇合度），转染时间（24h或48h）。 阅读提示：Methods: Cell culture and transfection |
| TRIM25和G3BP1共定位与共凝聚实验 | GFP-TRIM25或mCherry-TRIM25和GFP-G3BP1或mCherry-G3BP1质粒的共转染，poly(I:C)处理时间（6h或10h），图像采集设备和参数（Olympus FV3000或SpinSR10）。 阅读提示：Methods: Immunofluorescence microscopy and live-cell imaging |
| 体外LLPS实验 | 纯化的TRIM25和G3BP1蛋白浓度（如20μM），缓冲液成分（20mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 8% v/v Ficoll），核酸类型和浓度（56-bp dsRNA, 2-20ng/μl），荧光染料标记（Oregon-Green488, Cy3），TEV蛋白酶添加。 阅读提示：Methods: Protein expression and purification, In vitro phase separation assay |
| 泛素化实验 | 细胞处理（poly(I:C)）, TRIM25 WT或突变体（PTFGAAAA, ∆PTFG）表达，G3BP1 WT或KO细胞，免疫沉淀抗体（Flag, HA, Ub），体外泛素化反应体系（E1 0.5μM, UbcH5b 2.5μM, TRIM25 1μM, Ub 8μM, G3BP1 10μM, 56-bp dsRNA, RIG-I-2CARD-HA或ZC3HAV1-N-HA 2μM, 30°C 30min）。 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation and immunoblotting, In vitro ubiquitination assays, TUBE assay |
| 病毒感染实验 | SeV感染复数（MOI=1），感染时间（12h或16h或18h），TRIM25 KO细胞建立，qPCR检测的基因（SeV RNA, IFNβ, CXCL10, ISG56）。 阅读提示：Methods: Sendai virus infection, Establishment of KO cell lines using CRISPR–Cas9 genome editing, RT-qPCR |