临床样本及数据库分析
评估CCDC65在肺腺癌组织及细胞系中的表达水平及其与临床预后的关系。
利用TCGA数据库和KM plotter分析CCDC65表达与生存期；通过qRT-PCR和Western blot检测细胞系和组织中CCDC65表达；采用免疫组化检测组织芯片，结合临床病理特征进行统计分析。
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CCDC65，一种导致小鼠早期死亡的基因敲除，在肺腺癌中作为潜在的新型肿瘤抑制因子
CCDC65, a Gene Knockout that leads to Early Death of Mice, acts as a potentially Novel Tumor Suppressor in Lung Adenocarcinoma.
实验完整度
高研究包含临床样本分析、细胞系体外功能实验、转基因小鼠模型及体内成瘤实验，并通过Co-IP、CHX、泛素化、ChIP-qPCR和拯救实验等多层级机制验证。
主要模型
人肺腺癌细胞系A549、H1975、SPC-A1 CCDC65敲除小鼠（CCDC65+/+、+/-、-/-） 乌拉坦诱导的小鼠肺腺癌模型 裸鼠皮下异种移植瘤模型
重点核对
CCDC65在组织中的表达水平（TCGA数据库、免疫组化） CCDC65敲除小鼠的基因型和存活情况 乌拉坦诱导剂量和频次（1 g/kg腹腔注射，每周1次，持续20周） 细胞系中CCDC65过表达或敲低的效率 CHX和MG132处理浓度及时间
摘要
CCDC65是卷曲螺旋结构域蛋白家族的成员，我们课题组之前仅在胃癌中报道过该蛋白。我们首次基于TCGA数据库观察到其在肺腺癌中表达下调。CCDC65蛋白的减少被证明是促进肺腺癌临床进展的不利因素。随后，发现CCDC65-/-小鼠可能因脑积水而死亡。与CCDC65+/+小鼠相比，CCDC65+/-小鼠中CCDC65的下调显著增加了乌拉坦诱导的肺癌形成能力。在后续研究中，我们观察到CCDC65在体外和体内均发挥抑制细胞增殖的肿瘤抑制功能。分子机制研究表明，CCDC65招募E3泛素连接酶FBXW7诱导致癌转录因子c-Myc的泛素化降解，并减少c-Myc与ENO1启动子的结合，从而抑制ENO1的转录。此外，CCDC65还招募FBXW7通过泛素化修饰降解ENO1蛋白。ENO1的下调进一步减少了AKT1的磷酸化激活，从而使细胞周期信号失活。我们的数据表明，CCDC65通过招募FBXW7抑制c-Myc/ENO1诱导的细胞周期信号，在肺腺癌中是一个潜在的肿瘤抑制因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CCDC65在肺腺癌中的表达及其是否作为肿瘤抑制因子发挥作用，以及其潜在的分子机制。
- 核心机制
- CCDC65通过招募E3泛素连接酶FBXW7，促进c-Myc的泛素化降解，减少c-Myc与ENO1启动子的结合从而抑制ENO1转录；同时，CCDC65也招募FBXW7降解ENO1蛋白，ENO1下调进一步抑制AKT1磷酸化，使细胞周期信号失活。
- 主要证据
- 基于TCGA数据库、临床组织样本和细胞系中CCDC65表达下调；CCDC65基因敲除小鼠在乌拉坦诱导下肿瘤结节更多且更大；CCDC65过表达抑制细胞增殖和周期，并在裸鼠中减小肿瘤体积；Co-IP、CHX追逐、泛素化实验和ChIP-qPCR验证了CCDC65与c-Myc、FBXW7的相互作用及其对c-Myc降解和ENO1转录的调控。
- 研究意义
- 本研究揭示了CCDC65作为潜在肿瘤抑制因子在肺腺癌发病中的新机制，为肺腺癌的诊断和治疗提供了潜在的生物标志物和分子靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CCDC65基因敲除小鼠模型构建及表型分析
构建CCDC65敲除小鼠，观察其发育和存活情况，并评估CCDC65缺失对肿瘤发生的影响。
通过CRISPR/Cas9技术构建CCDC65敲除小鼠，并进行基因分型；观察不同基因型小鼠的出生率、存活率和生长发育；通过解剖和HE染色检查小鼠脑部及主要器官形态。
乌拉坦诱导肺腺癌模型
评估CCDC65表达下调对乌拉坦诱导肺腺癌发生的影响。
对CCDC65+/+和CCDC65+/-小鼠腹腔注射乌拉坦建立肺腺癌模型，观察小鼠肺部肿瘤结节数量和面积，并进行HE染色分析。
CCDC65对细胞增殖和周期的影响
验证CCDC65在体外对LUAD细胞增殖和细胞周期的影响。
构建CCDC65过表达和敲低的细胞系，采用CCK8、集落形成、EdU、流式细胞术检测细胞增殖和周期变化，并用Western blot检测周期相关蛋白表达。
裸鼠皮下成瘤实验
验证CCDC65在体内对肿瘤生长的抑制作用。
将稳定过表达CCDC65的SPC-A1或A549细胞和对照细胞皮下注射裸鼠，28天后取出肿瘤称重并检测增殖指标。
CCDC65与c-Myc、FBXW7的相互作用和泛素化降解机制
阐明CCDC65调控c-Myc和ENO1蛋白稳定性的分子机制。
通过Co-IP验证相互作用，免疫荧光检测共定位；CHX追踪实验检测蛋白半衰期；MG132处理检测蛋白酶体依赖性；泛素化实验检测泛素化水平；siFBXW7用于验证FBXW7的依赖。
c-Myc对ENO1转录的调控
验证c-Myc是否作为转录因子结合ENO1启动子并调控其转录。
通过ChIP-qPCR检测c-Myc与ENO1启动子区域的结合，结合JASPAR预测和ENCODE数据，并过表达c-Myc检测ENO1 mRNA表达。
AKT信号通路及拯救实验
验证CCDC65通过c-Myc/ENO1/AKT1通路抑制细胞增殖和周期，并明确下游调控。
Western blot检测AKT1磷酸化水平；在CCDC65过表达细胞中回补c-Myc、ENO1或使用AKT抑制剂MK2206，评估对细胞增殖和周期的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Vivacell | -- |
| DMEM培养基 | Vivacell | -- | |
| 胎牛血清 | Biowest | -- | |
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 蛋白检测 | CCDC65 抗体 | Proteintech | 24376-1-AP |
| ENO1 抗体 | Proteintech | 11204-1-AP | |
| c-Myc 抗体 | Proteintech | 10828-1-AP | |
| CCND1 抗体 | Proteintech | 60186-1-Ig | |
| p-AKT (Ser473) 抗体 | Proteintech | 66444-1-Ig | |
| DYKDDDDK 标签抗体 | Proteintech | 80010-1-RR | |
| mTOR 抗体 | Proteintech | 66888-1-Ig | |
| p-mTOR (Ser2448) 抗体 | Proteintech | 677778-1-Ig | |
| GSK3β 抗体 | Proteintech | 22104-1-AP | |
| p-GSK3β (Ser9) 抗体 | Proteintech | 67558-1-AP | |
| Anti-P-Akt1 (Ser473) 抗体 | Cell Signaling Technology | 9018 | |
| 小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 3420 | |
| 正常兔IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| p27抗体 | Cell Signaling Technology | 3686 | |
| p21抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 | |
| AKT1抗体 | Signalway Antibody | 48884 | |
| Flag抗体 | Sigma | F1804 | |
| β-actin抗体 | Bioworld | AP0060 | |
| GAPDH抗体 | Bioworld | AP0063 | |
| SuperKine™ 增强型抗体稀释液 | Abbkine | -- | |
| Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽 | Bio-Rad | -- | |
| Mini Trans-Blot 转印槽 | Bio-Rad | -- | |
| 化学发光成像系统 | Minichemi | -- | |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂盒 | Foregene | -- |
| 反转录 | 逆转录试剂盒 | Vazyme | -- |
| qPCR | CFX96 实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- |
| 免疫组化 | 链霉亲和素/过氧化物酶试剂盒 | ZSGB BIO | -- |
| DAB显色试剂盒 | ZSGB BIO | -- | |
| 基因分型 | 琼脂糖 | Leagene | -- |
| TAE电泳缓冲液 | Leagene | -- | |
| GelRed核酸染料 | Biosharp | -- | |
| GelDoc XR+ 凝胶成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 动物模型 | 乌拉坦 | Sigma | -- |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒（CCK8） | Vazyme | -- |
| Cell-Light EdU Apollo567 体外试剂盒 | Ribobio | -- | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 细胞周期 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 核糖核酸酶A | -- | -- | |
| 流式分析 | FACS caliber 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 免疫共沉淀 | 免疫沉淀裂解液 | Thermo Scientific | -- |
| 蛋白A/G磁珠 | Bimake | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 二抗 | Earthox | -- |
| 蛋白稳定性 | MG132 | Selleck | -- |
| 染色质免疫沉淀 | Pierce 磁珠法ChIP试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| 数据分析 | IBM SPSS Statistics 25 | IBM | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（A549、H1975等）来源，培养基（RPMI 1640、DMEM）和血清浓度（10% FBS），培养条件（37°C、5% CO2）。 阅读提示：见Materials and methods, Cell culture and reagents。 |
| 过表达/敲低细胞系构建 | 慢病毒载体（GFP标记）、转染试剂（Lipofectamine 2000）、siRNA序列，感染和筛选条件。 阅读提示：见Materials and methods, Transfection和Lentivirus infection。 |
| 细胞增殖检测 | 细胞铺板密度（CCK8 3000细胞/孔，集落形成200细胞/孔），CCK8孵育时间（2小时），集落培养时间（两周）。 阅读提示：见Materials and methods, Cell Counting Kit 8 assay和Colony formation assay。 |
| 细胞周期分析 | EdU实验细胞密度（5000细胞/孔），PI染色浓度（10 μg/mL），RNase A浓度（0.5 mg/mL），检测时间。 阅读提示：见Materials and methods, Cell-cycle analysis和5-Ethynyl-2'-deoxyuridine staining。 |
| 动物实验 | 小鼠品系（C57BL/6J，裸鼠）、周龄、乌拉坦剂量（1 g/kg）和给药方案（每周一次，20周），以及异种移植细胞数量（5×10^6）。 阅读提示：见Materials and methods, Lung adenocarcinoma model mouse和Tumor xenograft experiments。 |
| 机制研究 | CHX浓度（50 μg/mL）、MG132浓度（20 μM，处理4小时）、Co-IP抗体和磁珠条件，泛素化检测方法。 阅读提示：见Materials and methods, Cycloheximide chase assay and ubiquitination assay和Co-immunoprecipitation assay。 |