体外iTreg分化模型建立
建立小鼠及人iTreg体外分化体系，为研究脂肪酸代谢变化提供模型基础。
从小鼠脾脏或人外周血分离初始CD4+ T细胞，用CD3/CD28磁珠和IL-2诱导Th0，同时添加TGFβ1诱导iTreg分化。
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CUL3-KLHL25对ACLY的泛素化修饰诱导脂肪酸代谢重编程以促进iTreg分化
ACLY ubiquitination by CUL3-KLHL25 induces the reprogramming of fatty acid metabolism to facilitate iTreg differentiation.
实验完整度
高包含体外细胞实验、功能验证、机制验证及体内小鼠结肠炎模型等多个独立证据层级
主要模型
小鼠原代CD4+ T细胞 人外周血原代CD4+ T细胞 Cd4CreCul3fl/fl小鼠 T细胞转移结肠炎小鼠模型 DSS诱导结肠炎小鼠模型 OVA诱导过敏性腹泻小鼠模型
重点核对
SB204990使用浓度：100 μM rhTGFβ1浓度：2 ng/ml或0.5 ng/ml 分化时间：24小时或72小时 CPT1抑制剂依托莫司浓度：5 μM DSS浓度：2% (w/v)
摘要
诱导性调节性T（iTreg）细胞在免疫抑制中发挥核心作用。由于iTreg细胞是由活化T（Th0）细胞分化而来，细胞代谢发生剧烈变化，包括从脂肪酸合成（FAS）向脂肪酸氧化（FAO）的转变。尽管脂肪酸代谢的重编程至关重要，但调控iTreg分化过程中这一过程的机制仍不清楚。在此，我们揭示了在转化生长因子β1（TGFβ1）刺激下，ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）的酶活性在iTreg分化过程中显著下降。这种下降是由于CUL3-KLHL25介导的ACLY泛素化和降解所致。因此，丙二酰辅酶A（一种FAS中的代谢中间体，能够抑制FAO限速酶肉碱棕榈酰转移酶1（CPT1））减少。因此，ACLY的泛素化和降解促进FAO，进而促进iTreg分化。总之，我们提出TGFβ1-CUL3-KLHL25-ACLY轴是调控iTreg分化的重要途径，并为维持免疫稳态以预防免疫疾病提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TGFβ1刺激诱导iTreg分化过程中，脂肪酸代谢从FAS向FAO转换的调控机制尚不清楚，本研究旨在探究其分子机制。
- 核心机制
- TGFβ1通过CUL3-KLHL25介导ACLY在K530/K536/K544位点的泛素化降解，降低ACLY活性，减少丙二酰辅酶A，解除其对CPT1的抑制，增强FAO，进而促进iTreg分化。
- 主要证据
- 体外小鼠及人CD4+ T细胞分化实验显示TGFβ1促进ACLY泛素化降解；ACLY过表达或抑制分别损害或促进iTreg分化；CUL3敲除或敲低阻断ACLY降解并抑制iTreg分化；小鼠结肠炎模型中，iTreg过继转移缓解结肠炎，CUL3缺失削弱该效应，ACLY敲低可部分挽救。
- 研究意义
- 阐明TGFβ1-CUL3-KLHL25-ACLY轴调控iTreg分化，为维持免疫稳态和预防结肠炎等免疫疾病提供新见解，提示ACLY抑制剂在IBD治疗中的潜在应用价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测ACLY表达与活性变化
检测iTreg分化过程中ACLY表达及酶活性的变化，以确定其是否为关键调控点。
蛋白免疫印迹检测ACLY蛋白水平，RT-PCR检测mRNA水平，ACLY活性检测试剂盒检测酶活性。
验证ACLY对iTreg分化的功能
通过过表达和抑制ACLY，验证其对iTreg分化的功能影响。
利用慢病毒转染过表达ACLY，siRNA敲低ACLY，或用特异性抑制剂SB204990处理，检测iTreg分化比例。
脂肪酸代谢重编程分析
分析ACLY抑制后脂肪酸合成与氧化代谢的变化，寻找关键代谢中间体。
利用[U-13C]葡萄糖追踪实验检测FAS，检测丙二酰辅酶A水平，回补棕榈酸、丙二酰辅酶A等代谢物，检测CPT1活性及FAO水平。
机制：TGFβ1诱导ACLY泛素化降解
揭示TGFβ1调控ACLY蛋白稳定性及泛素化修饰的机制。
通过免疫共沉淀、泛素化检测、突变体功能性分析、siRNA敲低CUL3/KLHL25、CUL3敲除小鼠来源细胞等方法，验证CUL3-KLHL25介导的ACLY泛素化降解。
体内验证：结肠炎与过敏性腹泻小鼠模型
在体内模型中验证CUL3-KLHL25-ACLY轴对iTreg分化及疾病进程的影响。
采用T细胞过继转移结肠炎模型、DSS诱导的急性结肠炎模型、OVA诱导的过敏性腹泻模型，评估ACLY抑制或CUL3缺失对结肠炎及相关病理指标的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Sigma-Aldrich | R66504 |
| 胎牛血清 | Biological Industries | 04-001-01 | |
| Dynabeads小鼠T细胞激活剂CD3/CD28 | Gibco | 11453D | |
| Dynabeads人T细胞激活剂CD3/CD28 | Gibco | 11132D | |
| 重组小鼠IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| 重组人IL-2 | Gibco | PHC0026 | |
| 细胞分化诱导 | 重组人TGFβ1 | Peprotech | 100-21-10 |
| 药物处理 | SB204990 | Tocris Bioscience | 154566-12-8 |
| MG132 | Selleck | S2619 | |
| 亮抑酶肽 | Selleck | S7380 | |
| 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | 0216011080 | |
| PF05175157 | TOCRIS | 5709 | |
| 浅蓝菌素 | Biovision | 1579-5 | |
| 流式分析 | 抗小鼠CD4-FITC抗体 | BD Biosciences | 553046 |
| 抗小鼠CD25-PE抗体 | BD Biosciences | 561065 | |
| 抗小鼠Foxp3-Alexa Fluor 647抗体 | BD Biosciences | 560401 | |
| 抗人CD4-FITC抗体 | Biolegend | 357406 | |
| 抗人CD25-PE抗体 | Biolegend | 302605 | |
| 抗人Foxp3-Alexa Fluor 647抗体 | Biolegend | 320114 | |
| 抗小鼠CTLA4-PE-Cy7抗体 | Biolegend | 106311 | |
| 抗小鼠ICOS-PE-Cy7抗体 | Biolegend | 117421 | |
| 抗小鼠TIGIT-PE-Cy7抗体 | Biolegend | 142107 | |
| 抗小鼠IL-10-PE-Cy7抗体 | Biolegend | 505025 | |
| Western blot | 抗ACLY抗体 | Abcam | Ab40793 |
| 抗eGFP抗体 | Proteintech | 66002-1-Ig | |
| 抗Actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 免疫沉淀 | 抗CUL3抗体 | Santa Cruz | sc-166110 |
| 抗KLHL25抗体 | Santa Cruz | sc-100774 | |
| 抗UBR4抗体 | Abcam | Ab86738 | |
| 抗USP13抗体 | Santa Cruz | sc-514416 | |
| 抗泛素抗体 | Abcam | ab7780 | |
| Western blot | 抗Lamin b1抗体 | CST | 12586 |
| 抗β-Tubulin抗体 | Sigma | T0198 | |
| 抗ATP5A1抗体 | Bimake | A5288 | |
| 抗泛乙酰化抗体 | CST | 9441 | |
| 山羊抗兔二抗 | Signalway Antibody | L3012-2 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | Signalway Antibody | L3032-2 | |
| 细胞分选 | 小鼠CD4+初始T细胞分选试剂盒 | Biolegend | 480040 |
| 人CD4+初始T细胞分选试剂盒 | Biolegend | 480042 | |
| siRNA转染 | 小鼠T细胞核转染试剂盒 | Lonza | VPA1006 |
| 代谢物检测 | 小鼠甲羟戊酸ELISA试剂盒 | Sino Best Biological Technology | YX-132201M |
| 小鼠MCPT1 ELISA试剂盒 | Sino Best Biological Technology | YX-130316M | |
| 小鼠OVA特异性IgE ELISA试剂盒 | Sino Best Biological Technology | YX-152201M | |
| 小鼠甲羟戊酸-5-焦磷酸ELISA试剂盒 | Shanghai Ruifan Biological Technology | RF8872 | |
| 小鼠HMG-CoA ELISA试剂盒 | Shanghai Ruifan Biological Technology | RF8726 | |
| 细胞组分分离 | 线粒体分离试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C3601 |
| 细胞核/胞浆蛋白分离试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0028 | |
| 酶活性检测 | ACLY活性检测试剂盒 | Suzhou comin Biotechnology | ACL-1-Y |
| ACC活性检测试剂盒 | Suzhou comin Biotechnology | ACC-1-Y | |
| FASN活性检测试剂盒 | Suzhou comin Biotechnology | FASN-1-Y | |
| CPT1活性检测试剂盒 | Suzhou comin Biotechnology | CPT1-1-Y | |
| 代谢物检测 | 乙酰辅酶A荧光检测试剂盒 | BioVision | K317-100 |
| OAA检测试剂盒 | Sigma | MAK070 | |
| 流式分析 | 转录因子缓冲液套装 | BD | 562574 |
| 细胞增殖检测 | CFSE细胞增殖染料 | Biolegend | 423801 |
| CellTrace Violet细胞增殖染料 | Thermo Fisher | C34557 | |
| 代谢分析 | 线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | 103010-100 |
| Seahorse XF棕榈酸-BSA FAO底物 | Agilent | 102720-100 | |
| 细胞培养 | XF基础培养基 | Agilent | 103193-100 |
| 动物实验 | 卵清蛋白 | Sigma-Aldrich | A5503 |
| 病毒转导 | 聚凝胺 | Solarbio | H8761 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外iTreg分化 | 初始CD4+ T细胞分离方法、培养体系（RPMI 1640、FBS、IL-2浓度）、TGFβ1浓度（2 ng/ml或0.5 ng/ml）、刺激时间（24小时或72小时） 阅读提示：Methods: Induction of mouse iTreg in vitro 和 Induction of human iTreg in vitro |
| ACLY功能抑制 | SB204990使用浓度（100 μM）、作用时间 阅读提示：Methods: Induction of mouse iTreg in vitro（药物处理部分）、图1E图注 |
| 脂肪酸氧化检测 | Seahorse分析仪型号、细胞接种密度、棕榈酸-BSA浓度（167 μM棕榈酸与28 μM BSA结合）、L-肉碱浓度（0.5 mM）、线粒体功能调节剂浓度（Oligo 1 mM, FCCP 1.5 mM, Rot/Ant A 100 nM/1 mM） 阅读提示：Methods: Extracellular flux analysis |
| 代谢物检测 | 丙二酰辅酶A检测方法（HPLC）、样品处理（5%磺基水杨酸、50 μM DTE）、乙酰辅酶A和OAA检测试剂盒（Biovision、Sigma）、细胞组分分离方法 阅读提示：Methods: Assessment of metabolic molecules |
| 体内结肠炎模型 | 小鼠品系（C57BL/6J、Rag1-/-）、T细胞过继转移数量（5×10^5）、DSS浓度（2%）、SB204990给药剂量（37.5 mg/kg/d）、给药频率（每两天一次）、造模时间（7天或10天） 阅读提示：Methods: Mouse model of colitis 和 Evaluation of colitis in mice |