PC9细胞DTP表型评估
验证PC9细胞经厄洛替尼处理后能否产生药物耐受性持久细胞（DTPs）
PC9细胞以不同密度接种，用2 µM或20 µM厄洛替尼处理9天，每3天换液，测定存活细胞比例。
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可重复性项目：癌症生物学中未完成的注册报告中的实验
Experiments from unfinished Registered Reports in the Reproducibility Project: Cancer Biology.
实验完整度
低文献为多个未完成复制实验的汇总报告，实验多因技术或方法学挑战未完成，未提供完整的功能验证和机制验证。
主要模型
PC9细胞 患者来源的胶质母细胞瘤神经球（GSC83） 人乳腺上皮细胞（HMEC） 小鼠模型（C.B-17、SCID/beige、BL/6、CD4−/−）
重点核对
PC9细胞对厄洛替尼的敏感性（IC50） Tie2在GSC83、U87MG和HMVEC中的表达差异 GNAO1-R243H突变对软琼脂集落形成的影响 BRAF抑制剂对A375和D04细胞ERK磷酸化的影响 MAP3K8表达水平对PLX4720敏感性的影响
摘要
作为可重复性项目：癌症生物学的一部分，我们发布了注册报告，描述了计划如何复制2010年至2012年间发表的29篇高影响力临床前癌症生物学论文中的选定实验。18篇论文的复制实验已完成，复制研究报告已提交，其中17篇被eLife接受并发表，被拒的论文以预印本形式发布。在此，我们报告其余11篇论文的状态和结果。四篇论文开始了实验工作，但未获得任何实验结果即停止。两篇论文因进行实验时遇到预料之外的挑战而只获得了不完整的结果。其余五篇论文仅完成部分实验，其余实验因平凡的技术或预料之外的方法学挑战而未完成。这些论文的实验，连同可重复性项目：癌症生物学中尝试的其他实验，为重复临床前癌症生物学实验的挑战和已完成实验的可重复性提供了证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 部分未完成的复制实验能否为原始研究结果提供验证或洞见。
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- 部分复制实验获得初步结果，如PC9细胞DTP比例、Tie2表达差异、GNAO1-R243H促进锚定非依赖性生长等，但多数实验未完成。
- 研究意义
- 分享未完成的实验可为他人提供信息，避免重复工作，并提高研究透明度。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Tie2表达检测
验证胶质母细胞瘤干细胞样细胞是否表达内皮标记物Tie2
通过qRT-PCR检测GSC83、U87MG和HMVEC细胞中Tie2和18S rRNA的表达。
GNAO1突变对锚定非依赖性生长的影响
验证GNAO1-R243H突变是否能促进锚定非依赖性生长
HMEC细胞稳定表达空载体、野生型GNAO1或GNAO1-R243H，进行软琼脂集落形成实验。
BRAF抑制剂对ERK活性的影响
验证BRAF抑制剂是否在野生型BRAF和突变RAS细胞中矛盾性激活MEK/ERK通路
A375和D04细胞分别用DMSO、索拉非尼、SB590885或PD184352处理4小时，收集裂解物进行Western blot检测磷酸化ERK1/2。
MAP3K8表达与RAF抑制剂敏感性
验证高表达MAP3K8的BRAF(V600E)细胞是否对RAF抑制剂PLX4720耐药
对A375、HT-29和RPMI-7951细胞进行PLX4720剂量反应实验，测定GI50值。
NrasG12V诱导的衰老监测
验证致癌NrasG12V在肝脏的表达是否能诱导细胞衰老并依赖适应性免疫
通过水动力注射将NrasG12V或NrasG12V/D38A导入小鼠肝脏，在第6、12、30天检测Nras、p21和p16的表达。
IDH突变对2HG水平和组蛋白甲基化的影响
验证IDH突变是否导致2HG积累和组蛋白甲基化增强
HEK293T细胞转染IDH1或IDH2野生型或突变体，72小时后通过GC-MS检测2HG水平，并通过Western blot检测组蛋白甲基化标记。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| DMEM培养基 | ATCC | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | 厄洛替尼 | Cayman Chemical | 10483 |
| 厄洛替尼盐酸盐 | LC Laboratories | E-4007 | |
| 索拉非尼 | Selleckchem | S7397 | |
| SB590885 | Selleckchem | S2220 | |
| PD184352 | Selleckchem | S1020 | |
| PLX4720 | Selleckchem | S1152 | |
| MAP3K8激酶抑制剂 | EMD Millipore | 616373 | |
| 细胞培养 | Cellometer Auto T4细胞计数仪 | Nexcelom Bioscience | -- |
| 细胞活力检测 | Cell Titer Glo试剂 | Promega | G7571 |
| Synergy 2多功能酶标仪 | Bio-Tek | -- | |
| Syto60染料 | Molecular Probes | S11342 | |
| Western blot | Odyssey CLx红外成像系统 | LI-COR Biosciences | -- |
| 兔抗磷酸化EGFR (Y1068)抗体 | Cell Signaling Technology | 3777 | |
| 小鼠抗GAPDH抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-15738 | |
| IRDye 680RD偶联驴抗小鼠抗体 | LI-COR Biosciences | 926-68072 | |
| IRDye 800CW偶联驴抗兔抗体 | LI-COR Biosciences | 926-32213 | |
| RNA提取和qRT-PCR | TRI试剂 | -- | -- |
| 第一链cDNA合成试剂盒 | GE Healthcare | GE27-9261-01 | |
| qRT-PCR | 7500 Fast实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| 细胞转染 | XtremeGENE HP DNA质粒转染试剂 | Roche | 06366244001 |
| 逆转录病毒包装混合试剂 | Applied Biological Materials | E-510 | |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1空载体 | Clontech | 632520 | |
| Western blot | 小鼠抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 |
| 小鼠抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| HRP偶联兔抗小鼠抗体 | Abcam | ab6728 | |
| 细胞分选 | FACSAria II流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 细胞活力检测 | WST1细胞活力检测试剂盒 | Roche | 11644807001 |
| 动物实验 | pPGK-SB13转座酶质粒 | -- | -- |
| pT/CaggsNrasG12V转座子质粒 | -- | -- | |
| pT/CaggsNrasG12V/D38A转座子质粒 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 小鼠抗p16抗体 | Abcam | ab54210 |
| 小鼠抗p21抗体 | BD Biosciences | 556431 | |
| 小鼠抗Nras抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-31 | |
| 小鼠IgG1同型对照 | Sigma-Aldrich | M5284 | |
| 生物素化山羊抗小鼠抗体 | Thermo Fisher Scientific | TM-060-BN | |
| 代谢物检测 | GCMS-QP2010 Plus气相色谱质谱联用仪 | Shimadzu Scientific Instruments | -- |
| Western blot | 兔抗H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 |
| 兔抗H3K4me3抗体 | Millipore | 17-614 | |
| 兔抗H3K36me3抗体 | Abcam | ab9050 | |
| 兔抗H3K79me2抗体 | Cell Signaling Technology | 9757 | |
| 兔抗H3K9me2抗体 | Cell Signaling Technology | 9753 | |
| 兔抗H3K9me3抗体 | Abcam | ab8898 | |
| 兔抗IDH1抗体 | Proteintech | 12332-1-AP | |
| 小鼠抗IDH2抗体 | Abcam | ab55271 | |
| 兔抗磷酸化MEK1/2 (S217/221)抗体 | Cell Signaling Technology | 9154 | |
| 小鼠抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4696 | |
| 兔抗MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 8727 | |
| 兔抗Vinculin抗体 | Sigma-Aldrich | V4139 | |
| HRP偶联山羊抗兔抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| HRP偶联马抗小鼠抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 质粒提取 | Qiagen质粒大量提取试剂盒 | Qiagen | 12362 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分、培养条件、支原体污染检测、STR鉴定 阅读提示：Materials and methods - Cell lines and culture |
| DTP生成实验 | 细胞接种密度、药物浓度、处理时间、换液频率、存活细胞比例测定 阅读提示：Materials and methods - 部分复制：染色质介导的可逆药物耐受状态 |
| Tie2表达检测 | 细胞系、RNA提取方法、cDNA合成试剂盒、qPCR条件、内参基因 阅读提示：Materials and methods - 部分复制：通过胶质母细胞瘤干细胞样细胞的内皮分化实现肿瘤血管化 |
| 软琼脂集落形成实验 | 细胞系、稳定表达载体、细胞分选、软琼脂浓度、培养时间、集落计数标准 阅读提示：Materials and methods - 部分复制：人类癌症中的多样体细胞突变模式和通路改变 |
| Western blot | 抗体种类、稀释比例、蛋白上样量、电泳条件、封闭条件、成像系统 阅读提示：Materials and methods - 各复制实验的Western blot部分 |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度、药物浓度、处理时间、检测试剂盒、读数方式 阅读提示：Materials and methods - 细胞活力测定 |
| 动物实验 | 小鼠品系、性别、年龄、饲养条件、质粒准备、注射方法、注射体积、时间点、组织处理、免疫组化条件 阅读提示：Materials and methods - 部分复制：衰老监测 |
| 代谢物检测 | 细胞转染效率、代谢物提取方法、衍生化条件、GC-MS参数、标准曲线 阅读提示：Materials and methods - 部分复制：IDH突变损害组蛋白去甲基化并导致细胞分化阻断 |