体内CRISPR筛选鉴定IL20RA
系统鉴定调控卵巢癌跨腔转移的关键基因。
使用GeCKO v2.0文库感染SK-OV-3细胞，原位移植入NOD-SCID小鼠，经三轮筛选后对转移细胞进行sgRNA测序，富集分析鉴定候选基因。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
系统性CRISPR筛选揭示IL-20/IL20RA介导的免疫串扰抑制卵巢癌跨腔转移
A systematic CRISPR screen reveals an IL-20/IL20RA-mediated immune crosstalk to prevent the ovarian cancer metastasis.
实验完整度
高包含体内CRISPR筛选、体外细胞功能实验、条件培养基实验、巨噬细胞共培养、动物模型、患者样本验证及机制通路研究，多元证据支持结论。
主要模型
SK-OV-3人卵巢癌细胞系 ID8小鼠卵巢癌细胞系 RAW 264.7小鼠巨噬细胞系 THP-1人单核细胞系 C57BL/6和NOD-SCID小鼠模型 人卵巢癌临床样本
重点核对
体内CRISPR筛选使用GeCKO v2.0文库，感染SK-OV-3细胞后原位移植入NOD-SCID小鼠，经三轮筛选。 IL20RA敲降或重建后，在SK-OV-3和ID8模型中检测腹水量和腹膜转移结节数。 条件培养基实验中，IL-20刺激的IL20RA重建ID8细胞或IL20RA敲降SK-OV-3细胞，处理RAW 264.7、BMDM或THP-1巨噬细胞72小时。 巨噬细胞极化通过流式细胞术检测M1（MHCII+CD206-）和M2（MHCII-CD206+）亚群。 机制验证包括western blot检测p-STAT3、OAS1、Caspase-1、IL-18，以及ChIP-qPCR验证STAT3结合Oas1a启动子。
摘要
癌细胞经腹膜腔的跨腔扩散发生在大多数初诊卵巢癌患者中，并导致大多数癌症相关死亡。然而，卵巢癌细胞如何与腹膜基质细胞相互作用以逃避免疫监视仍 largely 未被探索。通过体内全基因组CRISPR/Cas9筛选，我们鉴定出IL20RA，其在卵巢癌患者腹膜转移过程中显著下降，是阻止卵巢癌跨腔转移的关键因子。在高转移性卵巢癌细胞中重建IL20RA可显著抑制跨腔转移。当卵巢癌细胞播散至腹膜腔时，会强烈诱导腹膜间皮细胞表达IL-20和IL-24，进而激活卵巢癌细胞中IL20RA下游信号以产生成熟IL-18，最终导致巨噬细胞极化为M1样亚型以清除癌细胞。因此，我们展示了IL-20/IL20RA介导的卵巢癌细胞与间皮细胞之间的串扰，支持一种抑制转移的免疫微环境。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 卵巢癌细胞如何与腹膜间皮细胞和巨噬细胞相互作用以逃避免疫监视并促进跨腔转移？
- 核心机制
- IL-20/IL20RA信号通过STAT3激活OAS/RNase L介导的NLR通路，促进成熟IL-18的产生，进而诱导巨噬细胞极化为M1样亚型，抑制卵巢癌跨腔转移。
- 主要证据
- 体内CRISPR筛选鉴定IL20RA；IL20RA敲降或重建改变小鼠模型中转移表型；条件培养基和共培养实验证实巨噬细胞极化；敲降IL-18或IL20RB阻断IL20RA效应；患者样本中IL20RA与转移和预后相关。
- 研究意义
- 研究揭示IL-20/IL20RA-IL-18轴在腹膜免疫微环境中的关键作用，提出IL-18蛋白可能作为晚期卵巢癌的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证IL20RA在肿瘤模型中的功能
验证IL20RA对卵巢癌跨腔转移的抑制作用。
在SK-OV-3细胞中敲降IL20RA，在ID8细胞中重建IL20RA，原位或腹腔注射到小鼠，评估腹水和转移结节形成。
检测IL20RA表达与患者预后相关性
评估IL20RA在人类卵巢癌中的临床意义。
收集20例浆液性卵巢癌患者的原发灶、腹水和转移结节配对样本，检测IL20RA蛋白和mRNA水平，并分析生存数据。
评估IL20RA对免疫细胞的影响
确定IL20RA是否影响腹膜免疫微环境中的免疫细胞组成。
通过流式细胞术分析腹水中巨噬细胞、T细胞和B细胞的比例及亚群变化。
体外验证IL20RA介导的巨噬细胞极化
确认IL20RA通过可溶性因子直接调控巨噬细胞极化。
使用IL-20刺激的IL20RA重建或敲降卵巢癌细胞的条件培养基处理巨噬细胞，检测M1/M2标记基因表达。
体内验证巨噬细胞在IL20RA抑制转移中的作用
证明重编程的巨噬细胞是IL20RA抑制转移所必需的。
将IL20RA教育过的BMDM与ID8细胞共注射，或使用氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞，评估对转移的影响。
鉴定腹膜腔中IL20RA配体来源
确定在腹膜腔中产生IL20RA配体的细胞类型。
向小鼠腹腔注射ID8细胞，检测腹膜组织中的配体表达，并通过组织染色确认来源。
解析IL20RA下游信号通路
阐明IL20RA激活后介导巨噬细胞极化的分子机制。
对IL-20刺激的IL20RA重建ID8细胞进行转录组分析，验证STAT3、OAS/RNase L-NLR通路和IL-18的产生。
验证IL-18的下游功能性
确认IL-18是介导IL20RA抗转移效应的必需下游因子。
敲降IL-18或IL20RB后，评估巨噬细胞极化和体内转移表型。
评估IL-18蛋白治疗潜力
测试重组IL-18蛋白对卵巢癌转移的治疗效果。
对原位移植ID8细胞的小鼠腹腔注射IL-18蛋白，评估腹水和转移结节的形成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A改良培养基 | Biological Industries | -- |
| DMEM培养基 | Biological Industries | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Biological Industries | -- | |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞分化 | 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- | |
| 红细胞裂解液 | Solarbio | -- | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 杀稻瘟菌素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche Life Science | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Merck | -- |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Merck | -- | |
| Tanon-5200成像系统 | Tanon | -- | |
| ELISA | 小鼠IL18 ELISA试剂盒 | Wuxin Donglin Sci & Tech Development | -- |
| 人IL18 ELISA试剂盒 | Wuxin Donglin Sci & Tech Development | -- | |
| 小鼠IL20 ELISA试剂盒 | Wuxin Donglin Sci & Tech Development | -- | |
| 小鼠IL24 ELISA试剂盒 | Wuxin Donglin Sci & Tech Development | -- | |
| Infinite M200 PRO酶标仪 | TECAN | -- | |
| 流式细胞术 | 抗CD16/CD32抗体 | eBioscience | -- |
| 抗CD45-PE抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD11b-APC抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗F4/80-APC/CY7抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗I-A/I-E-PERCP/CY5.5抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD206-FITC抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD11c-FITC抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗CD3-FITC抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD8-PE/CY7抗体 | eBioscience | -- | |
| 抗CD45R/B220-FITC抗体 | BD Biosciences | -- | |
| LSRFORTESSA流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FACSAria SORP分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| 免疫组化 | 抗原修复液 | Solarbio | -- |
| 生物素标记二抗 | Vector Laboratories | -- | |
| 链霉亲和素-HRP | Vector Laboratories | -- | |
| DAB底物 | ZSGB-BIO | -- | |
| Olympus BX53显微镜 | Olympus | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor-488荧光染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Alexa Fluor-594荧光染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DAPI染色液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Olympus FV1000共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qRT-PCR | M-MLV逆转录酶 | Promega | -- |
| SYBR Green SuperMix | Yeasen Biotech | -- | |
| LightCycler96系统 | Roche | -- | |
| 细胞迁移实验 | Transwell渗透支持系统 | Corning Inc | -- |
| Millipore transwell小室 | Millipore | -- | |
| 结晶紫 | Beyotime | -- | |
| 细胞计数 | Invitrogen Countess II FL自动细胞计数器 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 共培养 | 0.4 μm孔径Transwell | Merck | -- |
| 重组蛋白 | 小鼠重组IL-20蛋白 | Origene | -- |
| 小鼠重组IL-24蛋白 | R&D Systems | -- | |
| 人重组IL-20蛋白 | Sino Biological | -- | |
| 人重组IL-18蛋白 | Sino Biological | 10119-HNCE | |
| 细胞处理 | IL-18中和抗体 | R&D Systems | -- |
| 大鼠IgG1同型对照 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗体 | 抗IL20RA抗体 | Abcam | -- |
| 抗IL20RB抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗ACTB抗体 | Immunoway | -- | |
| 抗STAT3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗磷酸化STAT3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗磷酸化STAT3抗体 | Signalway Antibody | -- | |
| 抗IL18抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗OAS1A抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗OAS1抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗Caspase-1抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗ARG1抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗NOS2抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗IL20抗体 | Abclonal | -- | |
| 抗IL24抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗细胞角蛋白18抗体 | Abcam | -- | |
| 载体构建 | pLV-H1-EF1α-puro质粒 | Biosettia | -- |
| pLV-EF1α-MCS-IRES-Bsd质粒 | Biosettia | -- | |
| 蛋白表达 | pET-20b(+)载体 | Novagen | -- |
| BL21(DE3)感受态细胞 | CWBIO | -- | |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖凝胶 | Qiagen | -- |
| 内毒素去除 | 高性能内毒素去除琼脂糖树脂 | Yeasen Biotech | -- |
| 内毒素检测 | 动态浊度法鲎试剂 | Yeasen Biotech | -- |
| 组织裂解 | 组织研磨仪 | SCIENTZ-48 | -- |
| RNA测序 | BGI seq500测序平台 | BGI-Shenzhen | -- |
| ChIP | ChIP-IT Express试剂盒 | Active Motif | -- |
| CRISPR筛选 | GeCKO v2.0文库 | Addgene | -- |
| 统计 | GraphPad Prism 8.0软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内CRISPR筛选 | GeCKO v2.0文库感染SK-OV-3细胞的MOI、每轮筛选的细胞数量、筛选轮数、转移结节分离方法 阅读提示：Materials and methods: CRISPR/Cas9 knockout in vivo screening |
| 小鼠模型建立 | 细胞注射数量、注射体积、注射部位（原位左卵巢或腹腔）、小鼠品系、周龄和性别、处死时间点 阅读提示：Materials and methods: Murine OC models |
| 巨噬细胞极化分析 | 流式细胞术标志物选择、抗体克隆和稀释比例、巨噬细胞亚群定义、腹水采集时间 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry |
| 条件培养基实验 | IL-20刺激浓度和时间、CM收集方法、CM与新鲜培养基比例、巨噬细胞处理时间 阅读提示：Materials and methods: CM stimulation and co-culture system |
| 巨噬细胞清除实验 | clodronate脂质体剂量、注射频率和持续时间、对照组（PBS脂质体） 阅读提示：Materials and methods: Murine OC models |
| 重组IL-18治疗实验 | IL-18剂量、给药途径（腹腔注射）、给药频率、治疗时间 阅读提示：Materials and methods: Murine OC models |