禁食对结直肠癌细胞增殖和糖酵解的影响
观察禁食模拟是否影响CRC细胞增殖和葡萄糖代谢。
使用CCK8、EdU、Transwell、流式细胞术检测增殖、侵袭、细胞周期和凋亡；通过iTRAQ蛋白质组学、糖摄取、乳酸产生、ECAR/OCR等检测葡萄糖代谢；检测糖酵解相关酶的表达。
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禁食通过Fdft1介导的AKT/mTOR/HIF1α通路抑制结直肠癌的有氧糖酵解和增殖
Fasting inhibits aerobic glycolysis and proliferation in colorectal cancer via the Fdft1-mediated AKT/mTOR/HIF1α pathway suppression.
实验完整度
高研究包含体外细胞实验、动物模型、患者样本分析和多种功能验证，并进行了机制验证。
主要模型
CT26结直肠癌细胞 SW620结直肠癌细胞 BALB/c小鼠皮下移植瘤模型 人结直肠癌组织样本 PIK3CA突变细胞系HCT116和HT29
重点核对
禁食模拟培养基的组成（无糖DMEM、0.5 g/L葡萄糖、1%FBS） FDFT1过表达和敲低慢病毒载体及序列 FDFT1过表达和敲低的效率和稳定性 mTOR抑制剂rapamycin的剂量（1 mg/kg）和给药途径（腹腔注射） 动物模型中FMD的饮食方案
摘要
有证据表明，禁食在包括结直肠癌在内的多种癌症中发挥广泛的抗肿瘤作用。然而，这种反应背后的机制尚不清楚。我们研究了禁食对结直肠癌葡萄糖代谢和恶性肿瘤的影响。我们发现，在抑制结直肠癌细胞有氧糖酵解和增殖的过程中，禁食上调了胆固醇生成基因法尼基二磷酸法尼基转移酶1（FDFT1）的表达。此外，FDFT1的下调与结直肠癌的恶性进展和不良预后相关。而且，FDFT1在结直肠癌中起着关键肿瘤抑制因子的作用。机制上，FDFT1通过负调控AKT/mTOR/HIF1α信号传导来发挥其肿瘤抑制功能。此外，mTOR抑制剂可以与禁食协同抑制结直肠癌的增殖。这些结果表明，FDFT1是禁食反应的关键下游靶点，可能参与结直肠癌细胞的葡萄糖代谢。我们的结果为结直肠癌的治疗提供了启示，并提示胆固醇生成基因与糖酵解之间存在潜在的相互作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 禁食如何抑制结直肠癌的葡萄糖代谢和增殖，其分子机制是什么？
- 核心机制
- 禁食上调FDFT1表达，FDFT1通过负调控AKT/mTOR/HIF1α信号通路，抑制有氧糖酵解，从而抑制结直肠癌增殖。
- 主要证据
- 体外细胞实验（CCK8、EdU、克隆形成、Transwell、糖摄取和乳酸产生等）和体内小鼠模型（FMD和FDFT1过表达/敲低肿瘤生长）以及临床样本分析（FUSCC队列和TCGA数据库）共同证明。
- 研究意义
- 作者提出mTOR抑制剂可与禁食协同抑制结直肠癌增殖，为结直肠癌治疗提供潜在的治疗方法和靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FDFT1在结直肠癌中的表达及临床相关性
评估FDFT1在结直肠癌组织和细胞中的表达水平及其与患者预后的关系。
通过GEO数据库分析、iTRAQ蛋白质组学、qRT-PCR、Western blot、IHC染色等方法检测FDFT1表达；利用临床样本和TCGA数据库进行生存分析。
FDFT1对结直肠癌细胞增殖和糖酵解的影响
确定FDFT1在CRC细胞中的功能角色。
通过慢病毒介导FDFT1过表达和敲低，使用CCK8、EdU、克隆形成、Transwell、流式细胞术等方法检测细胞增殖、凋亡和周期；同时检测糖酵解相关指标。
FDFT1作为禁食下游靶点在体内外的验证
验证FDFT1是否介导禁食对CRC增殖和糖酵解的抑制作用。
在体外将FDFT1过表达或敲低与禁食模拟联合处理，检测细胞增殖和FDFT1水平；在体内将FDFT1过表达或敲低的CT26细胞植入小鼠，结合FMD，观察肿瘤生长和18F-FDG摄取。
FDFT1与mTOR信号通路的关系
探索FDFT1调控的下游信号通路。
通过iTRAQ蛋白质组学、IPA分析、Western blot检测FDFT1对mTOR及其下游靶点（pS6k、pS6、AKT、HIF1α）的影响；使用siRNA沉默mTOR、mTOR抑制剂和激活剂处理，观察对FDFT1表达及糖酵解和增殖的影响。
禁食和mTOR抑制剂联合治疗的效果
评估mTOR抑制剂与禁食在CRC治疗中的联合效应。
在小鼠模型中，单独或联合使用FMD和rapamycin，观察肿瘤生长、小鼠生存和FDFT1表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Biological Industries | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 禁食模拟 | 无糖DMEM | Gibco | -- |
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素 | -- | -- |
| 慢病毒生产 | 脂质体转染试剂2000 | Invitrogen | -- |
| psPAX2质粒 | -- | -- | |
| pMD2.G质粒 | -- | -- | |
| siRNA转染 | 脂质体转染试剂2000 | Invitrogen | -- |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Laboratories | -- |
| EdU检测 | Click-iT EdU成像试剂盒 | Invitrogen | #C10339 |
| Transwell实验 | Transwell迁移实验试剂盒 | BD Biosciences | #353097 |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶（PI） | Signalway Antibody | #CA002 |
| 细胞凋亡检测 | PE Annexin V凋亡检测试剂盒I | BD Biosciences | #559763 |
| 葡萄糖摄取检测 | 葡萄糖摄取荧光检测试剂盒 | Biovision | #K666-100 |
| 乳酸产生检测 | 乳酸比色检测试剂盒 | Biovision | #K627-100 |
| OCR和ECAR检测 | Seahorse XF96细胞外流量分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒 | Seahorse Bioscience | -- | |
| 细胞线粒体压力测试试剂盒 | Seahorse Bioscience | -- | |
| Western blot | BCA蛋白检测试剂 | -- | -- |
| FDFT1抗体 | Abcam | ab195046 | |
| mTOR抗体 | Abcam | ab10268 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling | #9272 | |
| Vinculin抗体 | Cell Signaling | #4650 | |
| HIF1α抗体 | Novus | NB100-105 | |
| GLUT1抗体 | Proteintech | 66290-1-Ig | |
| LDHA抗体 | Proteintech | 19987-1-AP | |
| HK2抗体 | Proteintech | 22029-1-AP | |
| PGK1抗体 | Proteintech | 17811-1-AP | |
| GPI抗体 | Abcam | ab66340 | |
| RNA提取和RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | -- | |
| ABI 7900HT实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 蛋白质组学 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | -- | |
| iTRAQ 8标标记试剂盒 | Sciex | -- | |
| Ultimate 3000系统 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Peaks Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | -- | |
| 动物实验 | BALB/c小鼠 | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | -- |
| 模拟禁食饮食（FMD） | -- | -- | |
| 雷帕霉素 | Santa Cruz Biotechnology | 53123-88-9 | |
| 18F-氟代脱氧葡萄糖 | -- | -- | |
| Inveon microPET/CT系统 | Siemens Medical Solutions | -- | |
| 总胆固醇检测 | 胆固醇/胆固醇酯定量试剂盒 | Abcam | ab65359 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | CT26、SW620、HCT116、HT29和NCM460细胞来源（ATCC）；培养基为DMEM（Biological Industries）加10%FBS（Gibco）和100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素；培养条件为37°C、5%CO2 阅读提示：Methods: Cells and reagents |
| 禁食模拟条件 | 禁食模拟培养基组成（无糖DMEM、0.5 g/L葡萄糖、1%FBS）；处理时间24h或48h 阅读提示：Methods: Cells and reagents |
| 慢病毒构建和稳定细胞系 | FDFT1过表达质粒PGMLV-CMV-FDFT1-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro，敲低质粒PGMLV-hU6-FDFT1-CMV-ZsGreen1-PGK-Puro；靶序列；转染脂质体2000；嘌呤霉素筛选 阅读提示：Methods: Lentivirus production and stable cell line selection |
| siRNA转染 | mTOR siRNA序列；转染试剂Lipofectamine 2000；转染条件（无血清培养基） 阅读提示：Methods: The siRNA transfection |
| 细胞增殖实验 | CCK8法：细胞密度3x10^3/孔；培养5天；加入CCK8溶液10μL；孵育4小时；检测450nm吸光度。EdU法：细胞密度1x10^5/孔；培养24h；用Click-iT EdU试剂盒标记。克隆形成实验：500细胞/孔；培养14天。Transwell：2x10^5细胞；上室无血清DMEM；下室10%FBS DMEM；培养24h 阅读提示：Methods: Cell proliferation assay, Colony-formation assay, EdU assay cells, Transwell migration assay |
| 细胞周期和凋亡 | PI染色；PE Annexin V凋亡试剂盒；流式细胞仪型号 阅读提示：Methods: Cell cycle and apoptosis analysis |
| 糖酵解检测 | 葡萄糖摄取试剂盒（Biovision #K666-100）；乳酸检测试剂盒（Biovision #K627-100）；按照说明书操作 阅读提示：Methods: Glycolysis analysis |
| OCR和ECAR | Seahorse XF96分析仪；细胞密度2x10^4；使用糖酵解压力测试试剂盒和细胞线粒体压力测试试剂盒 阅读提示：Methods: OCR and ECAR |
| Western blot | 抗体信息：FDFT1 (Abcam ab195046)，mTOR (Abcam ab10268)，AKT (Cell Signaling #9272)，vinculin (Cell Signaling #4650)，HIF1α (Novus NB100-105)，GLUT1 (Proteintech 66290-1-Ig)，LDHA (Proteintech 19987-1-AP)，HK2 (Proteintech 22029-1-AP)，PGK1 (Proteintech 17811-1-AP)，GPI (Abcam ab66340)；蛋白提取、BCA定量、SDS-PAGE、免疫印迹 阅读提示：Methods: Protein extraction and western blot analysis |
| RNA提取和qRT-PCR | TRIzol试剂；PrimeScript RT试剂盒；ABI 7900HT实时PCR系统；引物序列见补充表1 阅读提示：Methods: RNA isolation and quantitative real-time PCR |
| 蛋白质组学分析 | 蛋白质提取；胰蛋白酶消化；iTRAQ 8标标记；高pH分离；LC-MS/MS分析；PEAKS Studio分析软件；筛选标准（fold change >1.5，至少两个unique peptides，significance >13）；数据上传PXD012029 阅读提示：Methods: Proteomics |
| 临床样本 | 81例FUSCC患者，未接受术前化疗或放疗，2012-2013年手术切除；组织保存于-125°C 阅读提示：Methods: Clinical samples |
| 免疫组化 | FDFT1抗体（Abcam ab195046）；石蜡包埋组织 阅读提示：Methods: IHC staining |
| 动物模型和FMD | BALB/c小鼠（雌性，4-6周龄，18-20g）；皮下注射2x10^4细胞（CT26、FDFT1过表达或敲低）；FMD饮食组成和周期；对照组正常饮食TD.7912；葡萄糖补充（10mg/kg）在饮水中 阅读提示：Methods: Animal model |
| microPET/CT成像 | 每只小鼠尾静脉注射5.55MBq 18F-FDG；注射后1小时扫描10分钟；异氟烷麻醉；标准摄取值（SUVmax）计算 阅读提示：Methods: MicroPET/CT imaging |
| 体内rapamycin治疗 | rapamycin剂量1mg/kg/d，腹腔注射；开始时间：肿瘤可触及时 阅读提示：Methods: In vivo rapamycin treatment |
| 总胆固醇检测 | 使用Abcam胆固醇/胆固醇酯定量试剂盒（ab65359） 阅读提示：Methods: Total cholesterol levels |