鉴定PFKFB3的O-GlcNAc修饰
确定PFKFB3是否被O-GlcNAc修饰，以及缺氧条件下修饰的变化。
使用非天然叠氮糖标记SW1990和PANC-1细胞中的O-GlcNAc修饰蛋白，通过链霉亲和素沉淀和免疫印迹检测PFKFB3的修饰水平。稳定表达Flag-PFKFB3，并利用OGT shRNA敲低OGT，检测缺氧条件下的修饰变化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
PFKFB3的O-GlcNAc糖基化是肿瘤细胞在缺氧条件下增殖所必需的
O-GlcNAcylation of PFKFB3 is required for tumor cell proliferation under hypoxia.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内异种移植瘤模型及患者样本分析，并进行了功能验证（细胞增殖）和机制验证（修饰位点、蛋白相互作用）。
主要模型
SW1990细胞系 PANC-1细胞系 HPDE细胞系 裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
缺氧条件：1% O2, 5% CO2, 94% N2，37°C，处理12小时（部分实验24小时） OGT敲低：使用pGIPZ shRNA，序列为5'-TTTATCAGGATTGTGCATG-3' PFKFB3 S172A突变体：用于验证Ser172磷酸化位点的功能 ERK抑制剂PD98059（10 μM）处理1小时 肿瘤异种移植：SW1990细胞皮下注射3×10^6细胞至裸鼠
摘要
由O-GlcNAc转移酶（OGT）催化的蛋白质O-GlcNAc糖基化受到葡萄糖可用性的严格调控。在缺氧条件下，它上调并对于肿瘤细胞增殖至关重要。然而，其背后的机制仍不清楚。在这里，我们展示了糖酵解调节因子6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶（PFKFB3），它也在细胞核中促进细胞周期进程，在缺氧反应中被O-GlcNAc糖基化。PFKFB3的O-GlcNAc糖基化可以与缺氧激活的ERK在同一修饰位点Ser172上的磷酸化竞争。磷酸化的PFKFB3可以与蛋白G3BP2相互作用并保留在细胞质中；这反过来导致缺氧诱导的P27在细胞核中积累，导致细胞周期停滞。这样的通路被肿瘤细胞中高水平的PFKFB3 O-GlcNAc糖基化所损害，从而促进细胞周期进程。一致地，PFKFB3-Ser172磷酸化水平与胰腺癌患者中的OGT水平呈负相关。我们的发现揭示了一种O-GlcNAc糖基化介导的机制，在代谢应激下促进肿瘤细胞增殖，将异常的OGT活性与胰腺癌的肿瘤发生联系起来。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在缺氧条件下，OGT介导的O-GlcNAc糖基化如何促进肿瘤细胞增殖，其具体机制是什么？
- 核心机制
- 缺氧诱导PFKFB3在Ser172位点发生O-GlcNAc糖基化，该修饰与ERK介导的磷酸化竞争，阻止PFKFB3与G3BP2结合并滞留细胞质，从而维持PFKFB3的核定位，进而降解细胞周期抑制因子P27，促进细胞周期进程。
- 主要证据
- 在SW1990和PANC-1细胞中，OGT敲低增强缺氧诱导的PFKFB3磷酸化、G3BP2相互作用和细胞质滞留，导致P27积累和细胞增殖抑制；S172A突变体逆转这些效应；体内异种移植瘤实验证实S172A突变体促进肿瘤生长；患者样本中PFKFB3-S172磷酸化与OGT水平负相关，且与预后相关。
- 研究意义
- 本研究揭示了一种O-GlcNAc糖基化介导的机制，将异常的OGT活性与胰腺癌的肿瘤发生联系起来，为针对异常OGT活性和PFKFB3的肿瘤治疗策略提供了潜在的分子基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
定位O-GlcNAc修饰位点
确定PFKFB3被O-GlcNAc修饰的具体氨基酸残基。
通过质谱分析Flag-PFKFB3，鉴定可能的O-GlcNAc修饰位点。构建Ser171A/Ser172A和Ser486A/Ser491A突变体，检测缺氧条件下O-GlcNAc修饰水平的变化。
验证O-GlcNAc修饰对细胞周期的影响
研究PFKFB3的O-GlcNAc修饰是否影响缺氧条件下肿瘤细胞的细胞周期进程。
在SW1990和PANC-1细胞中敲低OGT或PFKFB3，检测P27蛋白水平、BrdU掺入和细胞计数，评估细胞增殖率。
探究细胞质滞留机制
确定OGT敲低下PFKFB3滞留细胞质的分子机制。
免疫沉淀分析PFKFB3与G3BP2的相互作用，并检查OGT敲低对核质分布的影响。使用抑制剂（PD98059, Ly294002, Compound C）处理，鉴定介导G3BP2相互作用的信号通路。
验证ERK磷酸化位点
证实ERK直接磷酸化PFKFB3的Ser172位点，并确定磷酸化对G3BP2结合的影响。
进行体外激酶实验，使用[γ-32P]ATP和PFKFB3野生型及突变体，检测磷酸化。使用GST pulldown检测磷酸化PFKFB3与G3BP2的结合。用PUGNAc抑制OGA，检测细胞中磷酸化和定位的变化。
评估S172磷酸化对细胞增殖的影响
确认PFKFB3-S172磷酸化在缺氧条件下抑制细胞增殖的作用。
在SW1990细胞中敲低内源PFKFB3，并回补RNAi抗性的野生型或S172A突变体，在OGT敲低背景下检测P27水平、核定位和细胞增殖。
体内验证肿瘤发生
验证OGT抑制PFKFB3-S172磷酸化在体内肿瘤发生中的作用。
将OGT敲低并回补WT或S172A PFKFB3的SW1990细胞皮下注射至裸鼠，监测肿瘤体积，并对肿瘤组织进行免疫沉淀和免疫印迹分析。
临床相关性分析
评估OGT和PFKFB3-S172磷酸化在胰腺癌患者中的表达水平及其与预后的关系。
对73例人胰腺癌组织切片进行免疫组化染色，检测OGT和PFKFB3-S172磷酸化水平，进行半定量评分，并进行生存分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| RPMI 1640培养基 | 文中未明确说明 | -- | |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| 缺氧处理 | 低氧培养箱 | BioSpherix, Ltd. | Proox Model 110 |
| 药物处理 | PD98059 | Cell Signaling Technology | -- |
| Ly294002 | Cell Signaling Technology | -- | |
| Compound C | Sigma | -- | |
| PUGNAc | Sigma | -- | |
| 免疫沉淀 | Anti-FLAG M2 磁珠 | Sigma | -- |
| 免疫印迹 | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap-Elite质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽-琼脂糖 | 文中未明确说明 | -- |
| Talon金属亲和树脂 | 文中未明确说明 | -- | |
| Ultrafree-15离心过滤器 | Millipore | -- | |
| O-GlcNAc检测 | Click-iT O-GlcNAc酶标记系统 | Invitrogen | -- |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | -- |
| 细胞增殖 | BrdU | Sigma | -- |
| 酶活性测定 | 磷酸果糖激酶活性比色测定试剂盒 | Sigma | -- |
| 免疫组化 | GTVision检测系统/小鼠兔二抗试剂盒 | 文中未明确说明 | -- |
| Nikon DS-Ri2显微镜 | Nikon | DS-Ri2 | |
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素 | 文中未明确说明 | -- |
| 抗体 | OGT抗体 (ab96718) | Abcam | ab96718 |
| G3BP2抗体 (ab86135) | Abcam | ab86135 | |
| Flag抗体 (#35535) | Signalway Antibody | #35535 | |
| Flag抗体 (F3165) | Sigma | F3165 | |
| PFKFB3抗体 (D7H4Q, #13123) | Cell Signaling Technology | #13123 | |
| β-actin抗体 (#4970) | Cell Signaling Technology | #4970 | |
| O-GlcNAc抗体 (CTD110.6, #9875) | Cell Signaling Technology | #9875 | |
| 磷酸化Erk抗体 (D155117) | Sangon Biotech | D155117 | |
| P27抗体 (AP027) | Beyotime | AP027 | |
| 流式 | 抗BrdU-FITC (11-5071) | eBioscience | 11-5071 |
| 免疫沉淀 | VeriBlot免疫沉淀检测试剂(HRP) (ab131366) | Abcam | ab131366 |
| 免疫印迹 | 二抗 | Beyotime | -- |
| 激酶实验 | ERK1 | R&D | -- |
| OGT | R&D | -- | |
| 蛋白纯化 | IPTG | 文中未明确说明 | -- |
| 谷胱甘肽-琼脂糖 | 文中未明确说明 | -- | |
| Talon金属亲和树脂 | 文中未明确说明 | -- | |
| Ultrafree-15离心过滤器 | Millipore | -- | |
| 质谱分析 | 测序级胰蛋白酶 | Promega | -- |
| Rapigest | Waters Corp | -- | |
| 细胞培养 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | -- |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Sigma | -- | |
| PUGNAc | Sigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与缺氧处理 | 细胞系来源（ATCC），培养基（DMEM或RPMI 1640），FBS浓度（10%），缺氧条件（1% O2, 5% CO2, 94% N2），温度（37°C），细胞融合度（60%），处理时间（12小时或24小时） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture, Hypoxic and glucose treatment |
| 基因敲低与过表达 | shRNA序列（OGT、PFKFB3、G3BP2），转染试剂（Lipofectamine 3000），筛选药物（潮霉素、嘌呤霉素） 阅读提示：Materials and methods: DNA constructs and mutagenesis, Transfection |
| O-GlcNAc修饰检测 | 点击化学标记方法（Click-iT系统），链霉亲和素沉淀，检测抗体（anti-PFKFB3） 阅读提示：Materials and methods: O-GlcNAcylation assay |
| 蛋白相互作用分析 | 免疫沉淀抗体（anti-Flag），裂解缓冲液成分，洗涤条件 阅读提示：Materials and methods: Immunoprecipitation (IP) and immunoblotting analysis |
| 体外激酶实验 | 激酶（ERK1），底物（GST-PFKFB3），ATP浓度，孵育时间（20分钟），温度（30°C） 阅读提示：Materials and methods: ERK treatment |
| 细胞增殖检测 | BrdU浓度（50 μM），孵育时间（1小时），固定和变性步骤，流式分析 阅读提示：Materials and methods: Cell proliferation assay |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系（nu/nu），年龄（6周），性别（雄性），每组数量（8），注射细胞量（3×10^6），注射体积（150 μl PBS），注射部位（皮下），肿瘤体积计算公式 阅读提示：Materials and methods: Mice |
| 临床样本分析 | 患者样本数（73），切片厚度（3-5 μm），抗原修复方法，一抗浓度（OGT 1:100, PFKFB3 pSer172 1:50），评分标准（强度0-2 × 面积1-3） 阅读提示：Materials and methods: Immunohistochemistry |