诱导CLP脓毒症模型
模拟小鼠脓毒症，用于评估PTUPB的保护作用。
对小鼠进行盲肠结扎穿刺（CLP），建立脓毒症模型。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
COX-2/sEH双重抑制剂PTUPB通过抗炎和抗氧化应激改善小鼠盲肠结扎穿刺所致脓毒症
A COX-2/sEH dual inhibitor PTUPB ameliorates cecal ligation and puncture-induced sepsis in mice via anti-inflammation and anti-oxidative stress.
实验完整度
高研究包含动物模型（CLP诱导的脓毒症小鼠）、组织病理学评估（H&E染色）、功能检测（肝肾功能、临床评分、生存率）、分子机制分析（Western blot、RT-qPCR）及氧化应激相关检测（SOD、MDA），涉及多个独立证据层级。
主要模型
CLP诱导的脓毒症C57BL/6小鼠 肝脏、肺和肾脏组织
重点核对
PTUPB给药方案：5 mg/kg，术前72、48、24小时皮下注射 CLP模型建立：22G针贯穿穿刺，中点结扎 实验分组：假手术组、CLP组、CLP+PTUPB组 样本量：生存率分析每组20只，其他检测n=5–9 检测终点：CLP后24小时
摘要
花生四烯酸可分别被环氧合酶-2（COX-2）和细胞色素P450（CYP）代谢产生前列腺素和环氧二十碳三烯酸（EETs）。而具有保护作用的EETs会被可溶性环氧化物水解酶（sEH）快速降解。我们已报道，用特异性抑制剂PTUPB双重抑制COX-2和sEH显示出抗肺纤维化和肾脏保护作用。然而，PTUPB对盲肠结扎穿刺（CLP）所致脓毒症的作用仍不清楚。本研究旨在探讨PTUPB对小鼠CLP所致脓毒症的保护作用及其潜在机制。我们发现在CLP小鼠的肝脏、肺和肾脏中，COX-2表达增加，而CYPs表达减少。PTUPB治疗显著提高了存活率，降低了临床评分和全身炎症反应，减轻了肝肾功能障碍，并改善了脓毒症小鼠的多器官损伤。此外，PTUPB治疗降低了脓毒症小鼠肝脏、肺和肾脏中缺氧诱导因子-1α的表达。重要的是，我们发现PTUPB治疗抑制了脓毒症小鼠肝脏和肺中NLRP3炎性小体的激活。同时，我们发现PTUPB减轻了氧化应激，这有助于NLRP3炎性小体的激活。总之，我们的数据首次证明，用PTUPB双重抑制COX-2和sEH可改善脓毒症小鼠的多器官功能障碍。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PTUPB（一种COX-2和sEH双重抑制剂）对小鼠CLP诱导的脓毒症是否具有保护作用及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- PTUPB通过抑制NLRP3炎性小体激活和减轻氧化应激来发挥保护作用，可能涉及上调SOD活性、降低MDA含量及调节HIF-1α通路。
- 主要证据
- 在CLP小鼠模型中，PTUPB治疗提高了生存率、降低了临床评分，减轻了肝、肾、肺的组织病理学损伤和功能障碍，并降低了组织中的NLRP3、pro-IL-1β、HIF-1α表达及氧化应激标志物（如MDA增加、SOD减少）。
- 研究意义
- 研究表明，靶向花生四烯酸代谢紊乱（通过双重抑制COX-2和sEH）可能为脓毒症提供一种有前景的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PTUPB预处理
评估PTUPB对CLP诱导脓毒症的保护作用。
在CLP前72、48、24小时，对小鼠皮下注射PTUPB（5 mg/kg）或溶剂PEG 400。
生存率与健康状况评估
评估PTUPB对脓毒症小鼠生存率和健康状态的影响。
监测小鼠生存率（每6小时）和临床评分。
肝肾功能检测
评估PTUPB对脓毒症小鼠肝肾功能的影响。
收集血清，使用自动生化分析仪检测BUN、Cre、ALT、AST、LDH、ALB和TP水平。
组织病理学评估
评估PTUPB对脓毒症小鼠多器官组织损伤的影响。
对肝脏、肺和肾脏进行H&E染色，由四位病理学家盲法评估器官损伤评分。
系统炎症反应检测
评估PTUPB对脓毒症小鼠全身炎症的影响。
检测外周血中性粒细胞百分比、组织中MPO活性、血清MCP-1水平及组织Mcp-1和Tnf-α mRNA表达。
NLRP3炎性小体激活检测
评估PTUPB对脓毒症小鼠NLRP3炎性小体激活的影响。
通过Western blot检测肝脏、肺和肾脏中NLRP3和pro-IL-1β蛋白表达。
氧化应激检测
评估PTUPB对脓毒症小鼠氧化应激的影响。
检测肝脏、肺和肾脏中MDA含量、SOD活性及Ho-1 mRNA表达。
HIF-1α表达检测
评估PTUPB对脓毒症小鼠HIF-1α表达的影响。
通过Western blot和实时PCR检测肝脏、肺和肾脏中HIF-1α蛋白和mRNA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型建立 | 复合碘 | -- | -- |
| 4-0丝线 | -- | -- | |
| 22G针头 | -- | -- | |
| 药物处理 | PTUPB | -- | -- |
| 聚乙二醇400 | -- | -- | |
| 血清生化分析 | 日立自动生化分析仪7000 | Hitachi | -- |
| 血液涂片 | Wright染色液 | Polysciences | -- |
| 组织MPO活性检测 | MPO试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | A001-1-2 |
| ELISA | MCP-1 ELISA试剂盒 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | BMS6005TEN |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Takara | -- |
| RT-qPCR | 逆转录系统试剂盒 | Takara | -- |
| SYBR Green荧光染料 | Takara | -- | |
| Bio-Rad实时荧光定量PCR系统（CFX96 Touch™） | Bio-Rad | CFX96 Touch™ | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | P0100 | |
| Pierce™ BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23229 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗COX-2抗体 | Servicebio | GB111037 | |
| 抗pro-IL-1β抗体 | R&D | AF-401-NA | |
| 抗NLRP3抗体 | CST | #15101 | |
| 抗HIF-1α抗体 | Immunoway | sc-13515 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Signalway | #21338 | |
| 抗GAPDH抗体 | Servicebio | GB11002 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Servicebio | GB13017-2 | |
| 抗兔二抗 | Signalway | #L3012-2 | |
| 抗山羊二抗 | absin | abs20005ss | |
| 抗小鼠二抗 | Signalway | L3032-2 | |
| 氧化应激检测 | SOD检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | A001-1-2 |
| MDA检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | A003-4-1 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系：C57BL/6；性别：雄性；体重：20±2g；麻醉：1%戊巴比妥钠；手术步骤：盲肠结扎和穿刺（22G针，中点结扎）；复苏：皮下注射预温生理盐水（37°C，5 mL/100g体重）。 阅读提示：Materials and Methods, section 2.2 |
| 药物处理 | PTUPB剂量：5 mg/kg；给药方式：皮下注射；给药时间：CLP前72、48、24小时；溶剂对照：PEG 400。 阅读提示：Materials and Methods, section 2.2 |
| 生存率与临床评分 | 生存率监测频率：每6小时；临床评分时间：CLP后24小时；评分标准：基于六项症状。 阅读提示：Materials and Methods, section 2.3; Results section 3.2; Figure 2 legend |
| 肝肾功能检测 | 血清样本采集：CLP后24小时，眼球摘除采血，3000 rpm离心10分钟；检测指标：BUN, Cre, ALT, AST, LDH, ALB, TP；使用自动生化分析仪。 阅读提示：Materials and Methods, section 2.4 |
| 组织病理学评估 | 组织固定：4%多聚甲醛；切片厚度：3μm；染色：H&E；损伤评分：肝脏（1-4分），肺（0-4分），肾脏（1-5分）；评分方式：四位病理学家盲法评分，每张切片3个视野。 阅读提示：Materials and Methods, section 2.7; Results section 3.4 |
| 系统炎症反应检测 | 中性粒细胞百分比：Wright染色，油镜下计数100个白细胞；MPO活性：试剂盒检测；血清MCP-1：ELISA（Cat: BMS6005TEN）；mRNA：实时PCR，使用特定引物序列（Table 1）。 阅读提示：Materials and Methods, sections 2.5, 2.6, 2.8; Table 1 |
| NLRP3炎性小体激活检测 | 蛋白检测：Western blot；抗体：NLRP3（CST #15101），pro-IL-1β（R&D AF-401-NA）；内参蛋白：β-肌动蛋白、β-微管蛋白或GAPDH。 阅读提示：Materials and Methods, section 2.9; Results section 3.6 |
| 氧化应激检测 | MDA含量和SOD活性检测：使用试剂盒（Cat: A003-4-1和A001-1-2）；Ho-1 mRNA表达：实时PCR，使用特定引物序列（Table 1）。 阅读提示：Materials and Methods, sections 2.8 and 2.10; Results section 3.7 |
| HIF-1α表达检测 | 蛋白检测：Western blot；抗体：HIF-1α（Immunoway sc-13515）；mRNA检测：实时PCR，使用特定引物序列（Table 1）。 阅读提示：Materials and Methods, sections 2.8 and 2.9; Results section 3.8 |