建立MCAO/R模型并给予tPA和茯苓酸
建立局灶性脑缺血再灌注模型，模拟临床急性缺血性卒中tPA溶栓治疗，并评估茯苓酸的治疗效果。
雄性C57BL/6J小鼠行MCAO/R手术，阻断大脑中动脉1小时后恢复血流，再灌注同时经股静脉给予tPA，并口服不同剂量茯苓酸（20、40、80 mg/kg）。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
茯苓酸靶向PI3K/Akt信号通路减轻缺血性卒中后tPA诱导的出血性转化
Pachymic Acid Targets PI3K/Akt Signaling Pathway to Attenuate tPA-Induced Hemorrhagic Transformation After Ischemic Stroke.
实验完整度
高包含体内动物模型（MCAO/R）、分子对接/MD/SPR验证直接靶向，结合PI3K抑制剂LY294002的功能验证，展示多层级实验证据。
主要模型
雄性C57BL/6J小鼠MCAO/R模型
重点核对
MCAO/R模型建立：C57BL/6J小鼠，线栓法阻塞大脑中动脉1小时 tPA给药：再灌注后立即经股静脉给药，剂量10 mg/kg，首剂10%于1分钟注入，其余90%于30分钟注入 茯苓酸给药：口服灌胃，剂量20、40、80 mg/kg PI3K抑制剂：LY294002脑室内注射，剂量10 mM，10 μL，注射速度1 μL/min 评估时间点：再灌注后24小时
摘要
组织型纤溶酶原激活剂（tPA）诱导的脑出血性转化（HT）限制了其在缺血性卒中后的广泛应用。茯苓酸是茯苓的主要活性成分，可减轻脑缺血/再灌注损伤，但其对tPA诱导的HT的影响尚不清楚。通过建立局灶性大脑中动脉闭塞/再灌注模型，给予tPA和茯苓酸处理，在再灌注24小时后评估梗死体积和神经功能，并使用伊文思蓝渗漏、免疫荧光和Western blot评估血脑屏障（BBB）损伤，利用分子对接、分子动力学模拟和表面等离子体共振鉴定茯苓酸与PI3K蛋白的相互作用。结果显示，与tPA组相比，茯苓酸剂量依赖性地改善神经和运动功能，减少梗死体积和出血量，减轻缺血性卒中后BBB的通透性和紧密连接蛋白降解，在高剂量时效果最显著。分子对接、MD模拟和SPR结果表明茯苓酸可直接与PI3K蛋白结合。进一步实验显示，PI3K抑制剂LY294002逆转了茯苓酸的保护作用。研究表明，茯苓酸通过靶向PI3K激活PI3K/Akt信号通路保护BBB，从而减轻缺血性卒中后tPA诱导的HT。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究茯苓酸是否能减轻缺血性卒中后tPA诱导的出血性转化，并阐明其潜在机制。
- 核心机制
- 茯苓酸直接结合PI3K蛋白，激活PI3K/Akt信号通路，保护血脑屏障完整性，从而减轻tPA诱导的出血性转化。
- 主要证据
- 在MCAO/R小鼠模型中，茯苓酸剂量依赖性地减少梗死体积、出血量和神经功能缺损，减轻BBB通透性，恢复紧密连接蛋白表达，MMP-9表达下调；分子对接、MD模拟和SPR证实茯苓酸与PI3K直接结合（KD=5.89×10⁻⁵ mol/L）；PI3K抑制剂LY294002逆转了这些保护作用。
- 研究意义
- 研究表明茯苓酸有望成为缺血性卒中研究中减轻tPA溶栓后出血性转化的潜在治疗药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
神经行为学评估
评估茯苓酸对tPA处理后MCAO/R小鼠神经功能缺损的改善作用。
采用mNSS评分、足部失误测试和黏胶去除测试评估神经功能。
评估脑梗死体积与出血性转化
评估茯苓酸对tPA诱导的脑梗死和出血性转化的影响。
TTC染色评估梗死体积；脑冠状切片出血评分和血红蛋白含量测定评估出血程度。
评估血脑屏障完整性
评估茯苓酸对tPA诱导的BBB损伤的保护作用。
伊文思蓝渗漏试验、Western blot和免疫荧光检测紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin、Claudin-5）和MMP-9表达。
验证茯苓酸与PI3K的直接结合
探索茯苓酸保护BBB的分子靶点。
分子对接预测茯苓酸与PI3K的结合，MD模拟和SPR验证直接相互作用。
验证PI3K/Akt通路介导的保护作用
确证茯苓酸通过PI3K/Akt通路发挥保护作用。
使用PI3K抑制剂LY294002，检测PI3K/Akt信号通路蛋白和紧密连接蛋白表达，以及出血和神经行为学变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型建立 | 异氟烷 | -- | -- |
| 6-0单丝线栓 | -- | -- | |
| 药物处理 | tPA（阿替普酶） | Boehringer Ingelheim | -- |
| 茯苓酸 | lemeitian | 29070-92-6 | |
| LY294002 | -- | -- | |
| 血液动力学监测 | MoorVMS-LDF2激光多普勒血流仪 | Moor Instruments | -- |
| 免疫荧光染色 | CD31抗体 | Servicebio | GB11063-3-100 |
| ZO-1抗体 | Invitrogen | 339100 | |
| MMP-9抗体 | Abcam | Ab283575 | |
| Occludin抗体 | Invitrogen | 404700 | |
| Claudin-5抗体 | Invitrogen | 900900 | |
| Alexa Fluor 488二抗 | Huabio | HA1125 | |
| Alexa Fluor 594二抗 | Huabio | HA1122 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 蔡司倒置荧光显微镜（ZEISS Axio Vert. A1） | Zeiss | -- | |
| Western blot | ZO-1抗体 | Invitrogen | 339100 |
| Occludin抗体 | Invitrogen | 404700 | |
| Claudin-5抗体 | Invitrogen | 900900 | |
| PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | 4292S | |
| p-PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | 17366T | |
| p-Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4060S | |
| Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272S | |
| β-微管蛋白抗体 | Huabio | ET1602-4 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Huabio | EM21002 | |
| Amersham Imager 680成像系统 | GE Healthcare | -- | |
| RIPA裂解缓冲液 | -- | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| SPR | Biacore T100表面等离子体共振仪 | GE Healthcare | -- |
| 重组人PI3K蛋白 | Sino Biological | P27-122DH-50 | |
| CM5传感芯片 | GE Healthcare | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MCAO/R模型建立 | 小鼠品系、性别、年龄、体重、麻醉方案、线栓规格、缺血时间、成功标准（脑血流下降>70%）。 阅读提示：详见Methods 2.1和2.2节，及图1A图注。 |
| 药物处理方案 | tPA剂量（10 mg/kg）、给药途径（静脉）、给药时间（再灌注后）、给药方式（首剂10%于1分钟，余90%于30分钟）；茯苓酸剂量（20, 40, 80 mg/kg）、给药途径（口服灌胃）、溶剂（5% DMSO生理盐水）；LY294002剂量（10 mM，10 μL）、给药途径（脑室内注射）、注射参数（深度2.0 mm，速度1 μL/min）。 阅读提示：详见Methods 2.3和2.11节。 |
| 神经行为学评估 | 评估时间点（再灌注后24小时）、测试方法（mNSS、足部失误、黏胶去除）、样本量（n=8）。 阅读提示：详见Methods 2.4节及图1E-G图注。 |
| 脑梗死和出血评估 | TTC染色浓度和切片厚度（1.5% TTC，1 mm）；出血评分标准（0-4分）；血红蛋白定量方法（Drabkin试剂，540 nm）。 阅读提示：详见Methods 2.5-2.7节及图1B-D, H-I图注。 |
| BBB完整性评估 | 伊文思蓝浓度和剂量（2%，4 mL/kg）、给药途径（尾静脉）、检测时间点；紧密连接蛋白检测方法（Western blot, 免疫荧光）和抗体信息；MMP-9免疫荧光。 阅读提示：详见Methods 2.8-2.10节及图2, 3, 4图注。 |
| PI3K/Akt信号通路验证 | LY294002给药方案；蛋白检测方法（Western blot）和抗体信息；结果解释需注意通路抑制对下游蛋白的影响。 阅读提示：详见Methods 2.10, 2.11节及图6, 7图注。 |
| 分子结合分析 | 分子对接软件和参数；MD模拟软件及参数；SPR实验条件（蛋白浓度、配体浓度范围、流速、温度）。 阅读提示：详见Methods 2.12, 2.13节及图5图注。 |