蛋白表达与纯化
获得功能性的PfMDR1蛋白，用于后续活性测定和结构解析
使用HEK293F细胞重组表达PfMDR1，经LMNG增溶和亲和纯化获得纯化蛋白，并通过ATPase活性验证其功能。
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恶性疟原虫MDR1抑制的结构和机制见解
Structural and mechanistic insights into the inhibition of Plasmodium falciparum MDR1.
实验完整度
高包含冷冻电镜结构解析、ATPase活性测定、突变体功能验证以及分子对接等多层级实验验证。
主要模型
表达于HEK293F细胞的野生型及突变体PfMDR1蛋白 表达于HEK293F细胞的人ABCB1蛋白 PfMDR1与ACT-451840复合物的冷冻电镜结构模型 PfMDR1与MFQ复合物的结构模型（PDB: 8JWF）
重点核对
PfMDR1蛋白表达宿主为HEK293F细胞，培养基为SMM293-TII Expression Medium ATPase活性测定中，PfMDR1浓度为0.05 mg/ml，ATP浓度为4 mM ACT-451840抑制ATPase活性的IC50值：野生型为352.0 ± 16.7 nM 冷冻电镜结构确定：ACT-451840结合于PfMDR1中央腔，分辨率为3.42 Å 关键结合残基突变（F74A、Y290A、F331A、Y1076A）导致IC50显著升高
摘要
疟疾由寄生虫恶性疟原虫引起，仍然是全球健康的主要威胁，多药耐药对治疗构成重大挑战。P-糖蛋白同源物恶性疟原虫多药耐药蛋白1（PfMDR1）是对甲氟喹（MFQ）和氯喹等一线抗疟药耐药的关键决定因素。ACT-451840是一种临床I期药物，已被开发为抗疟候选药物，但其作用机制和与耐药标志物的相互作用仍有待充分理解。在此，我们展示了PfMDR1与ACT-451840复合物的冷冻电镜结构，分辨率为3.42 Å。该结构揭示ACT-451840结合在中央腔内，并将PfMDR1锁定在向内开放构象，抑制其基础ATP酶活性。ACT-451840结合状态与先前报道的MFQ结合状态的结构比较，为ACT-451840耐药突变如何导致MFQ增敏提供了分子解释。此外，与人ABCB1的比较结构分析和生化表征揭示了ACT-451840对PfMDR1的选择性抑制机制。我们的发现为ACT-451840的抑制机制提供了结构基础，这可能为未来靶向PfMDR1的抗疟候选药物的开发提供信息。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ACT-451840如何抑制PfMDR1，其耐药突变如何导致甲氟喹增敏，以及其选择性抑制机制是什么？
- 核心机制
- ACT-451840结合于PfMDR1中央腔，将其锁定在向内开放构象，抑制其ATPase活性和底物转运。耐药突变（如G316R）可能通过改变转运动力学，增加MFQ在细胞质中的浓度，增强其杀虫效果。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构显示ACT-451840结合于PfMDR1中央腔，ATPase活性测定证实其抑制作用，突变体功能实验验证了关键结合残基。
- 研究意义
- 为ACT-451840的抑制机制提供了结构基础，可能指导未来针对PfMDR1的抗疟药物优化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ATPase活性测定
验证ACT-451840对PfMDR1的直接抑制作用
测定不同浓度ACT-451840下PfMDR1的ATPase活性，使用孔雀绿磷酸盐检测试剂盒定量无机磷酸盐。
冷冻电镜结构解析
确定ACT-451840结合PfMDR1的结构，揭示抑制机制
将PfMDR1与ACT-451840孵育后制备冷冻电镜样品，收集数据并处理，最终确定复合物的结构。
结合残基突变验证
验证结构预测的关键结合残基对ACT-451840抑制活性的影响
构建关键残基（F74A、Y290A、F331A、Y1076A等）的突变体，测定其ATPase活性抑制IC50值。
耐药突变分析
阐明PfMDR1耐药突变（G316R、Y1076H等）对ACT-451840结合的影响
将已知耐药突变映射到结构上，并通过ATPase活性测定评估突变对抑制剂效力的影响。
选择性抑制机制分析
解释ACT-451840对PfMDR1选择性抑制的分子基础
比较PfMDR1与人ABCB1的结构差异，结合分子对接和突变体功能实验，分析选择性原因。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | HEK293F细胞 | ThermoFisher Scientific | R79007 |
| 细胞培养 | SMM293-TII表达培养基 | Sino Biological | M293TII |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966 |
| 蛋白纯化 | 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷 | Bluepus | -- |
| 月桂基麦芽糖新戊二醇 | Anatrace | -- | |
| Strep-Tactin XT树脂 | IBA | -- | |
| D-脱硫生物素 | Sangon | -- | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | -- | |
| 冷冻电镜样品制备 | ACT-451840 | MCE | -- |
| Quantifoil Au R1.2/1.3 | -- | -- | |
| 冷冻电镜数据采集 | Titan Krios电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Gatan K2 Summit探测器 | Gatan | -- | |
| ATPase活性测定 | 孔雀绿磷酸盐检测试剂盒 | BioAssay Systems | DATG-200 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | HEK-293F细胞密度（2×10⁶ cells/mL），转染后收获时间（60小时），离心条件（3000 g, 15分钟, 4°C），裂解缓冲液组成（100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 2% DDM等），纯化缓冲液条件（0.01% LMNG），洗脱缓冲液（含50 mM D-desthiobiotin），SEC缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% LMNG） 阅读提示：Methods - Protein expression and purification |
| ATPase活性测定 | 蛋白浓度（0.05 mg/ml），ATP浓度（4 mM），化合物预孵育时间（10分钟），反应时间（20分钟），温度（37°C） 阅读提示：Methods - ATPase activity assay |
| 冷冻电镜样品制备与数据采集 | ACT-451840浓度（10 mM），孵育时间（30分钟），载网型号（Quantifoil Au R1.2/1.3），滤纸时间（3秒），像素大小（1.1 Å），总剂量（约7.089 e⁻/Ų） 阅读提示：Methods - Grid preparation and cryo-EM data collection |
| 冷冻电镜数据处理 | 最终颗粒数（337,745），分辨率（3.43 Å） 阅读提示：Methods - Cryo-EM data processing |
| 分子对接 | 使用AutoDock Vina v1.2.0，搜索框大小（40 Å），exhaustiveness（8），输出构象数（10） 阅读提示：Methods - Molecular docking |