转录组分析及NF-κB通路动态变化
明确SARS-CoV-2感染对宿主免疫通路特别是NF-κB的影响
对SARS-CoV-2感染（MOI=2）的Calu-3细胞在6、24、48、72 hpi进行RNA-seq分析，通过Mfuzz聚类和PROGENy通路活性分析，发现NF-κB通路活性在24和48 hpi上调，在72 hpi下调。
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SARS-CoV-2 Nsp1通过促进TAK1激酶的泛素依赖性降解来抑制经典NF-κB通路
SARS-CoV-2 Nsp1 suppresses the canonical NF-κB pathway by promoting ubiquitin-dependent degradation of TAK1 kinase.
实验完整度
高包含细胞模型（HEK293T、A549、Caco-2）和感染模型（SARS-CoV-2感染Calu-3细胞、ΔN RDP感染N-Caco-2细胞）等多个证据层级，并通过功能验证（报告基因、基因表达）和机制验证（Co-IP、SPR、泛素化分析）明确验证了Nsp1抑制NF-κB的机制。
主要模型
Calu-3细胞感染SARS-CoV-2（MOI=2） N-Caco-2细胞感染ΔN SARS-CoV-2 RDPs HEK293T细胞过表达Nsp1 A549细胞过表达Nsp1
重点核对
验证Nsp1对NF-κB通路活性的抑制作用（p65和IκBα磷酸化水平） 验证Nsp1与TAK1的结合及TAK1蛋白水平的变化 验证Nsp1对TAK1 K48泛素化的促进作用及蛋白酶体抑制剂的逆转作用 验证TRIM21在Nsp1介导的TAK1泛素化中的作用 验证IL-1β刺激下Nsp1对NF-κB和MAPK通路的抑制
摘要
SARS-CoV-2表达的免疫调节蛋白干扰感染细胞中的宿主抗病毒防御，并在COVID-19的发病机制和临床表现中发挥关键作用。在这里，我们建立了一种预测算法，通过整合预训练的蛋白质语言模型和免疫相关通路中的基因权重，来量化SARS-CoV-2蛋白对宿主免疫的扰动。结果显示，经典NF-κB通路受到SARS-CoV-2感染的动态调节，非结构蛋白1（Nsp1）显著抑制了其他病毒蛋白和促炎细胞因子（如IL-1β）对NF-κB通路的激活。Nsp1与TAK1的TAB1结合域结合，促进TRIM21介导的K48连接的泛素化和随后的蛋白酶体蛋白降解，导致NF-κB信号通路失活。这项工作提出了一个在通路水平上识别病毒免疫调节因子的新框架，并为SARS-CoV-2的免疫逃逸提供了机制见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2感染如何动态调节NF-κB通路，以及哪些病毒蛋白参与该调节？
- 核心机制
- Nsp1通过与TAK1的TAB1结合域结合，阻断TAK1-TAB1复合物形成，并通过促进TRIM21介导的K48连接泛素化导致TAK1蛋白酶体降解，从而抑制NF-κB、MAPK和AP-1信号通路。
- 主要证据
- GWPIS预测和实验验证了Nsp1对NF-κB通路的抑制作用；Co-IP和SPR证实Nsp1与TAK1结合；泛素化实验证明Nsp1促进TAK1的K48泛素化并通过蛋白酶体降解；TRIM21敲低实验证实其参与Nsp1介导的TAK1泛素化。
- 研究意义
- 该研究揭示了SARS-CoV-2通过Nsp1调控宿主NF-κB通路的机制，为理解病毒免疫逃逸和开发靶向NF-κB的药物或免疫疗法提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
GWPIS预测病毒蛋白对NF-κB通路的调控
预测SAR-CoV-2蛋白中调控NF-κB通路的候选因子
基于D-SCRIPT和PROGENy权重计算GWPIS，预测Nsp1等为潜在调控因子，并在HEK293T细胞中过表达Nsps验证p65磷酸化水平。
Nsp1与TAK1的相互作用及功能验证
验证Nsp1与TAK1的相互作用并定位结合域
通过Co-IP、SPR确定Nsp1与TAK1的N端（1-303 aa）结合，并检测Nsp1对TAK1蛋白水平的影响。
Nsp1对NF-κB、MAPK和AP-1通路的抑制
验证Nsp1对TAK1下游信号通路的影响
在HEK293T和A549细胞中过表达Nsp1，检测p65、IκBα、p38、ERK磷酸化水平及AP-1启动子活性，并验证IL-1β刺激下的抑制效果。
泛素化机制研究
阐明Nsp1促进TAK1降解的分子机制
通过泛素化实验检测Nsp1对TAK1泛素化水平的影响，使用K48R/K63R突变体确定泛素链类型，通过MG132抑制蛋白酶体验证降解途径，并分析TAK1突变体K209A/K589A对泛素化的影响。
TRIM21的作用验证
验证TRIM21是否为Nsp1介导TAK1泛素化的E3连接酶
通过Co-IP确认TRIM21与TAK1的相互作用，通过shRNA敲低TRIM21检测对Nsp1诱导的TAK1泛素化的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
RNA-seq分析及生物信息学
功能及信号通路验证
病毒感染模型
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | #SH30022.01 |
| 胎牛血清 | Cell-Box | #SV30087.03 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | #15140122 | |
| EMEM培养基 | Lonza | #BE12-136F | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | #A3382001 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | #G7513 | |
| 青霉素 | Sigma-Aldrich | #P4458 | |
| 非必需氨基酸 | Lonza | #BE13-114E | |
| 嘌呤霉素 | Beyotime | #ST551 | |
| 转染 | LipoMax转染试剂 | Sudgen | #32012 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | #89900 |
| 蛋白酶抑制剂迷你片 | Thermo Fisher Scientific | #A32955 | |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | #23227 |
| 免疫沉淀 | anti-FLAG磁珠 | Thermo Fisher Scientific | #A36798 |
| anti-cMYC磁珠 | Thermo Fisher Scientific | #88842 | |
| SDS上样缓冲液 | Sangon Biotech | #C508320 | |
| 免疫印迹 | PVDF膜 | Millipore | #ISEQ00010 |
| 抗体稀释液 | NCM Biotech | #WB500D | |
| 吐温20 | Sigma | #V900548 | |
| HRP标记山羊抗兔抗体 | HuaBio | #HA1001 | |
| HRP标记山羊抗鼠抗体 | HUABIO | #HA1006 | |
| ChemiDOC MMP成像系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 抗SARS-CoV-2 Nsp1抗体 | ABclonal | #A20200 | |
| 抗TAB1抗体 | CST | #3226 | |
| 抗TAK1抗体 | CST | #5206S | |
| 抗磷酸化IκBα-S32抗体 | ABclonal | #AP0707 | |
| 抗磷酸化Erk1/2抗体 | HUABIO | #ET1610-13 | |
| 抗磷酸化p38 MAPK抗体 | CST | #9211 | |
| 抗磷酸化p65 (Ser311)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | #sc-135769 | |
| 抗磷酸化p65 (Ser536)抗体 | CST | #3033T | |
| 抗IκBα抗体 | ABclonal | #A19714 | |
| 抗Erk1/2抗体 | HUABIO | #ET1601-29 | |
| 抗p38 MAPK抗体 | CST | #9212 | |
| 抗p65抗体 | Santa Cruz Biotechnology | #sc-514451 | |
| 抗泛素N端抗体 | PTM Biolabs | #PTM-1106RM | |
| 抗GFP抗体 | Proteintech | #66002 | |
| 抗HA标签抗体 | ABclonal | #AE008 | |
| 抗FLAG抗体 | CST | #14793 | |
| 抗Strep抗体 | HUABIO | #HA722229 | |
| 抗GAPDH抗体 | CST | #2118 | |
| 抗cMYC抗体 | Sigma | #C3956 | |
| RNA干扰 | pLKO.1-TRC载体 | Addgene | #10878 |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | #12260 | |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | #12259 | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | #15596018 |
| RT-qPCR | HiScript III一步法RT SuperMix qPCR试剂盒 | Vazyme | #R333-01 |
| SYBR Green预混液 | Yeasen | #11184ES08 | |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| 荧光素酶报告基因 | pGL4.7载体 | Promega | #E6881 |
| 荧光素酶检测试剂盒 | Yeasen | #11401ES60 | |
| Infinite M200酶标仪 | Tecan | -- | |
| 重组蛋白表达 | pTO-T7质粒 | -- | -- |
| 大肠杆菌ER2566菌株 | NEB | #E4130G | |
| 蛋白纯化 | AKTA纯化系统 | Cytiva | -- |
| Ni-Excel树脂 | Cytiva | #17-3712-03 | |
| 蛋白分析 | Young's PAGE凝胶 | Genscript | -- |
| SPR分析 | TAK1蛋白 | SinoBiological | #M15-13G |
| TRIM21蛋白 | MCE | #HY-P71791 | |
| BIAcore 8K+分子互作分析仪 | Cytiva | -- | |
| CM5传感芯片 | Cytiva | -- | |
| RNA-seq | TriPure试剂 | Roche | #11667157001 |
| NEBNext Poly(A) mRNA磁珠 | NEB | #E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒 | NEB | #E7530 | |
| HiSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| 药物处理 | MG132 | -- | -- |
| IL-1β | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（HEK293T、A549、Calu-3）来源为ATCC；培养基种类、血清浓度、抗生素；培养条件（37°C、5% CO2）；N-Caco-2细胞需添加嘌呤霉素（2 μg/mL） 阅读提示：Methods: Cell lines and cell culture |
| 病毒感染 | SARS-CoV-2感染Calu-3细胞MOI=2，感染时间1小时，时间点6-72 hpi；ΔN RDP感染N-Caco-2细胞MOI=0.01或0.001，参考文中的具体描述 阅读提示：Methods: Culture of SARS-CoV-2 and ΔN-SARS-CoV-2 RDPs; Results: Fig 1g, S5a |
| 质粒转染 | 使用的表达质粒（pcDNA3.1、pGL4.7等）及标签；转染试剂LipoMax；转染时间和用量（如Nsp1质粒0.5-4 μg） 阅读提示：Methods: DNA constructs and cell transfection |
| 免疫印迹 | 细胞裂解液（RIPA）及蛋白酶抑制剂；抗体稀释液；PVDF膜；一抗和二抗的选择；信号检测系统（ChemiDOC） 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation and immunoblotting |
| 泛素化实验 | HA-Ub质粒类型（WT、K48R、K63R）；转染顺序（先转TAK1和HA-Ub，24h后再转Nsp1）；免疫沉淀使用anti-FLAG磁珠；MG132处理浓度（0-10 μM）和时间（12小时） 阅读提示：Methods: Ubiquitination assays; Results: Fig 5 |
| 荧光素酶报告基因 | 报告质粒（2个NF-κB响应元件或GJA1、CDH3、NECTIN2启动子）；细胞密度（5×10^5）；两次转染的时间间隔（24小时）；检测试剂和仪器 阅读提示：Methods: Luciferase reporter assays |
| SPR分析 | TAK1和Nsp1蛋白浓度；传感器芯片CM5；缓冲液（PBS、pH 4.0醋酸缓冲液）；接触时间、解离时间、流速 阅读提示：Methods: Expression of the Nsp1 recombinant protein |