H3K4me3模式分析
探究造血发育过程中不同细胞类型的H3K4me3分布变化。
对CMP、CLP、pro-B、pre-B、成熟B细胞和巨噬细胞进行CUT&Tag，分析H3K4me3分布并聚类。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CFP1介导的H3K4me3广泛结构域控制早期B细胞谱系命运决定
CFP1-mediated H3K4me3 broad domains control early B cell lineage fate determination.
实验完整度
高包含体外细胞培养、基因敲除小鼠模型、CUT&Tag、ChIP、RNA-seq、V(D)J-HTGTS和4C-HTGTS等多层次功能与机制验证。
主要模型
小鼠骨髓pro-B细胞（CD19+CD43+） Cfp1条件性敲除小鼠（Cfp1f/fMb1Cre） v-Abl细胞系
重点核对
Cfp1敲除的pro-B细胞在IL-7和SCF存在下的增殖能力 H3K4me3-BD的宽度和信号变化（CUT&Tag） IgH基因座上H3K4me3和RAG2的结合（ChIP） V(D)J重组效率（半定量PCR和HTGTS） IgH基因座收缩（4C-HTGTS）
摘要
组蛋白H3K4me3广泛结构域（BD）是一种独特的表观遗传特征，标记与细胞身份相关的基因，但它在谱系分化中的生理作用仍不清楚。在这里，我们表明CFP1是Setd1A/B甲基转移酶复合物的一个组成部分，对于功能性H3K4me3-BD的安装和B细胞命运决定至关重要。Cfp1缺失损害了B谱系基因子集上的H3K4me3-BD，并将H3K4me3从活性基因重新分布到二价启动子。部分由于RNA聚合酶II在启动子和基因体上的减少，H3K4me3-BD结合基因子集的转录减少。具体来说，CFP1消融消除了免疫球蛋白重链（IgH）基因中重组中心和远端PAIR元件上的H3K4me3-BD，严重损害了其有效的V-to-DJ重组所必需的基因座收缩，并因此将细胞阻滞在pro-B阶段。此外，Cfp1缺陷的pro-B细胞上调了一组祖细胞和髓系特异性基因，并具有升高的H3K4me3标记，并且可以转分化为各种髓系细胞类型。因此，我们的研究揭示了CFP1介导的H3K4me3-BD在细胞谱系命运特化和定向的转录调控中的关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CFP1介导的H3K4me3广泛结构域在早期B细胞谱系命运决定中的生理作用是什么？
- 核心机制
- CFP1通过Setd1A/B复合物建立H3K4me3-BD，调控B谱系基因表达和IgH基因座收缩，促进V(D)J重组，并抑制非B谱系基因表达，从而决定B细胞命运。
- 主要证据
- Cfp1缺失导致H3K4me3-BD减少、RNA Pol II结合降低、V(D)J重组受阻、pro-B细胞阻滞，并出现髓系转分化；通过CUT&Tag、ChIP、RNA-seq和4C-HTGTS等验证。
- 研究意义
- 揭示了CFP1介导的H3K4me3-BD在细胞谱系命运决定中的关键作用，为理解表观遗传调控B细胞发育提供了新机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CFP1缺失对pro-B细胞功能的影响
验证CFP1在pro-B细胞增殖和维持中的作用。
通过Cfp1条件性敲除小鼠和v-Abl细胞敲除，检测增殖、细胞周期和基因表达。
H3K4me3-BD分析
确定CFP1对H3K4me3-BD建立的作用。
比较WT和Cfp1-KO pro-B细胞的H3K4me3峰值宽度和信号变化。
转录调控分析
探究CFP1介导的H3K4me3-BD对基因表达的影响。
进行RNA-seq和Pol II CUT&Tag，分析差异表达基因和Pol II结合。
V(D)J重组分析
评估CFP1对V(D)J重组的影响。
通过半定量PCR和HTGTS检测V-DJ和V-DJ重组效率，并分析VH使用。
IgH基因座收缩分析
探究CFP1对IgH基因座空间结构的影响。
使用4C-HTGTS检测iEμ与VH区域及PAIR元件的相互作用。
谱系可塑性分析
检测Cfp1缺陷pro-B细胞是否具有髓系分化潜能。
在MGS条件下培养pro-B细胞，检测CD11b+髓系细胞出现。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Corning | 10040-CV |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | FSP500 | |
| 白细胞介素-7 | PeproTech | 217-17-10UG | |
| 干细胞因子 | Sino Biological | 50487-M08B | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Sino Biological | 51112-MNAH-20 | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Sino Biological | 51048-MNAH-20 | |
| 流式细胞术 | 抗CD19磁珠 | Miltenyi | 130-121-301 |
| 抗IgM抗体 | Biolegend | 405229 | |
| CUT&Tag | 抗H3K4me3抗体 | Millipore | 07-473 |
| 抗H3K27me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9733 | |
| 抗CTCF抗体 | ABClonal | A19588 | |
| 抗H3K27ac抗体 | Active Motif | 39133 | |
| 抗H3K4me1抗体 | Abcam | Ab176877 | |
| 抗RNA聚合酶II抗体 | Cell Signaling Technology | 2629 | |
| ChIP | 抗RAG2抗体 | ABClonal | A12488 |
| 抗PAX5抗体 | Santa Cruz | Sc-13146 | |
| 抗CFP1抗体 | Abcam | ab198977 | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| V(D)J-HTGTS | 链霉亲和素磁珠 | Invitrogen | 65002 |
| 4C-HTGTS | NlaIII限制酶 | New England Biolabs | R0125L |
| 流式细胞术 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 细胞培养 | 4D核转染仪 | Lonza | V4LC-2520 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | Cfp1f/f和Mb1Cre小鼠的遗传背景、年龄和性别（6-12周） 阅读提示：Materials and methods, Mice |
| pro-B细胞分离 | 骨髓细胞分离、CD19+CD43+流式分选纯度 阅读提示：Materials and methods, Bone marrow pro-B cell purification |
| 细胞培养 | 培养基组成、IL-7和SCF浓度（10 ng ml-1）、起始密度（20 × 104 cells ml-1） 阅读提示：Materials and methods, Bone marrow pro-B cell purification |
| CUT&Tag | 细胞数量（~5 × 10^4）、抗体用量（0.5 μl） 阅读提示：Materials and methods, CUT&Tag |
| ChIP | 细胞数量（200 × 10^4）、MNase用量（1 U per 200 × 10^4 cells） 阅读提示：Materials and methods, Chromatin immunoprecipitation |
| RNA-seq | RNA提取方法、文库构建试剂盒 阅读提示：Materials and methods, Strand-specific RNA-seq and data processing |
| V(D)J-HTGTS | DNA用量（0.5-2 μg）、引物 阅读提示：Materials and methods, V(D)J-HTGTS and analysis |
| 4C-HTGTS | 细胞数量（12 × 10^4）、甲醛浓度（2%）、限制酶（NlaIII） 阅读提示：Materials and methods, 4C-HTGTS and analysis |