计算设计
设计IL-7变体，通过移除冗余环区并重新连接螺旋，提高折叠效率和稳定性。
使用Rosetta loop remodeling和fix backbone设计，结合AlphaFold2进行结构预测验证。
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白细胞介素-7超级因子（superkine）的靶向计算设计：增强折叠效率和免疫治疗功效
Targeted computational design of an interleukin-7 superkine with enhanced folding efficiency and immunotherapeutic efficacy.
实验完整度
高包含计算设计、酵母展示筛选、SPR结合分析、细胞增殖实验、小鼠模型和RNA-seq等多层级验证，且明确进行功能验证和机制验证。
主要模型
酵母展示系统（EBY100酵母菌株） 小鼠MC38结肠癌同系移植瘤模型 C57BL/6J小鼠 2E8细胞系（IL-7依赖性小鼠B细胞系）
重点核对
α螺旋1上的二硫键稳定化（G4C/L96C突变）对IL7Rα结合至关重要 Q6P和T45I突变增强Neo-7对IL7Rα的亲和力 Fc融合蛋白（含LALAPG突变）用于延长半衰期 体内实验中单次腹腔注射剂量10 mg/kg MC38肿瘤模型中，Fc-Neo-7（Q6P-T45I）显示最强的肿瘤抑制效果
摘要
白细胞介素-7（IL-7）在维持T细胞发育和免疫稳态中发挥核心作用，增强该细胞因子的免疫刺激功能对多种肿瘤恶性肿瘤具有广泛的治疗意义。在此，我们展示了一种计算设计的IL7超级因子Neo-7，其表现出增强的折叠效率和对其同源受体的优越结合亲和力。为了简化蛋白质候选预测和验证过程，我们战略性靶向IL7的环区进行重新设计，同时保留了大部分受体相互作用区域。利用AlphaFold2等先进计算工具，我们展示了环重塑以纠正结构不规则性，从而允许蛋白质骨架的迭代稳定，并导致识别有利于受体结合的有利突变。Neo-7超级因子显示出改善的热稳定性和生产产量，并在C57BL/6J小鼠中表现出增强的免疫刺激和抗癌效果。Neo-7解决了IL-7的内在可开发性限制，包括低效折叠、聚集倾向和次优受体结合，而野生型IL-7的体内药代动力学限制则通过Fc融合单独解决。这些发现强调了靶向计算方法用于从头细胞因子开发的实用性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过靶向计算设计改造IL-7的骨架，以提高其折叠效率、稳定性和受体结合亲和力，从而增强其免疫治疗潜力？
- 核心机制
- 通过去除冗余环区并重新连接螺旋，减少二硫键数量，提高折叠效率；在螺旋1上引入二硫键稳定化，恢复与IL7Rα结合所必需的结构弯曲；Q6P/T45I突变增强对IL7Rα的结合亲和力，从而增强下游信号传导。
- 主要证据
- 酵母展示和流式细胞术验证突变对结合的影响；SPR测定显示Neo-7变体对mIL-7Rα的亲和力高于WT-IL-7；2E8增殖实验证实生物活性；MC38小鼠模型显示Fc-Neo-7（Q6P-T45I）具有最强肿瘤抑制效果，且肿瘤内CD8+ T细胞浸润增加。
- 研究意义
- 该研究展示了靶向计算设计在开发治疗相关细胞因子中的实用性，通过提高稳定性和可开发性，为癌症免疫治疗提供了潜在的新型IL-7变体，并可能推广至其他白细胞介素的设计。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
酵母展示验证
初筛Neo-7变体的表达和受体结合能力。
将设计基因克隆至酵母展示载体，通过流式细胞术检测与IL7Rα和IL2Rγ的结合。
点突变优化
通过引入关键点突变增强受体结合亲和力。
基于结构分析，引入Q6P、T45I等突变，通过酵母展示筛选最佳变体。
重组蛋白表达与表征
在大肠杆菌和CHO细胞中表达重组Neo-7，评估其产量、纯度、热稳定性和结合动力学。
使用Ni-NTA亲和层析和FPLC纯化，通过SYPRO分析热稳定性，SPR测定结合动力学，2E8增殖实验验证生物活性。
体内药效评价
评估Fc-Neo-7融合蛋白在体内的免疫刺激和抗肿瘤活性。
在C57BL/6J小鼠中单次腹腔注射10 mg/kg，分析外周血和肿瘤浸润免疫细胞，测量肿瘤生长。
转录组分析
研究Fc-Neo-7处理对脾CD8+ T细胞基因表达的影响。
分离脾CD8+ T细胞进行RNA测序，进行PCA、GO和GSEA分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白表达与纯化
结合动力学分析
体内免疫效果评估
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Iscove改良杜氏培养基 | Gibco | 12440053 |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 蛋白表达纯化 | Ni-NTA树脂 | -- | -- |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL 尺寸排阻色谱柱 | Cytiva | -- | |
| 结合分析 | CM5芯片 | Cytiva | -- |
| 流式细胞术 | Alexa Fluor 488 抗HA.11抗体 | Biolegend | 901509 |
| Alexa Fluor 647 抗His标签抗体 | Biolegend | 362611 | |
| Alexa Fluor 647 抗HA.11抗体 | Biolegend | 682404 | |
| PE抗人IgG-Fc抗体 | Abcam | ab131612 | |
| 细胞功能实验 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| 蛋白表达 | B-PER细菌蛋白提取试剂 | Thermo Scientific | -- |
| 细胞培养 | 白细胞介素-7 | Sino Biological | -- |
| 受体结合分析 | 小鼠IL-7Rα | -- | -- |
| IL-7Rα | Sino Biological | 50090-M08H | |
| IL-2Rγ | Sino Biological | 50087-M03H | |
| 分子克隆 | gBlock基因片段 | IDT | -- |
| 动物实验 | MC38细胞 | Millipore/Sigma-Aldrich | SCC172 |
| 细胞培养 | CHO-S细胞 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 2E8细胞 | ATCC | TIB-239 | |
| 蛋白表达 | Expifectamine CHO转染试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 流式细胞术 | eFluor780 eBioscience可固定活性染料 | eBioscience | -- |
| Pacific Blue-CD45抗体 | -- | -- | |
| PerCP/Cyanine5.5-CD45抗体 | -- | -- | |
| APC-CD4抗体 | -- | -- | |
| AlexaFluor-CD8a抗体 | -- | -- | |
| Alexa Fluor647-Ly6G抗体 | -- | -- | |
| FITC-CD11B抗体 | -- | -- | |
| Pacific Blue-CD11B抗体 | -- | -- | |
| BrilliantViolet421-F4/80抗体 | -- | -- | |
| FITC-MHCII抗体 | -- | -- | |
| PE-IFN-γ抗体 | -- | -- | |
| Brilliant Violet 785-TNF-α抗体 | -- | -- | |
| RNA测序 | EasySep小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | -- |
| TRIzol试剂 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 计算设计 | PDB结构3DI2，Rosetta环重塑和fix backbone设计参数，AlphaFold2预测模式（单序列和多聚体），RMSD阈值<1.0 阅读提示：Materials and methods: Helix definition and loop remodeling; Prediction of protein structure using AlphaFold 2 and AlphaFold Multimer |
| 酵母展示结合分析 | EBY100酵母菌株，诱导条件（SGCAA培养基含2%半乳糖，18小时），受体浓度（IL7Rα 50 nM，IL2Rγ 100 nM），孵育时间（30分钟至1小时），温度4°C 阅读提示：Materials and methods: Yeast transformation and induction of yeast-displayed proteins; Assessing expression level and receptor binding analysis of yeast-displayed neo-7 using flow cytometry |
| 重组蛋白表达与纯化 | E. coli BL21表达条件（18°C，48小时，无IPTG），Ni-NTA亲和层析，FPLC条件（Superdex 200 Increase 10/300 GL），WT-IL7的变性复性条件（6 M胍盐酸，透析复性），CHO表达条件（Expifectamine转染，8% CO2，10天） 阅读提示：Materials and methods: Expression and purification of recombinant Neo-7 in E. coli (BL21); Design and expression of recombinant Neo-7-Fc fusion |
| 结合动力学分析 | SPR芯片固定mIL-7Rα浓度（20 µg/mL），分析物浓度系列（三倍稀释），流速（50 µL/min），结合/解离时间（180/600秒），再生条件（3 M MgCl2，30秒） 阅读提示：Materials and methods: Surface Plasmon Resonance (SPR) analysis of neo-7 binding affinity to murine IL7Rα |
| 细胞功能实验 | 2E8细胞培养条件（IMDM，2 ng/mL IL-7，20% FBS），增殖实验细胞数（1×10^5），IL-7浓度（1和10 ng/mL），培养时间（3天），CCK-8试剂孵育时间（3小时） 阅读提示：Materials and methods: In vitro validation of neo-7 bioactivity |
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠，单次腹腔注射10 mg/kg，MC38肿瘤细胞接种量（1×10^5），治疗开始时间（第5天），肿瘤体积计算公式，血液采集时间点（D0, 3, 7, 12天） 阅读提示：Materials and methods: In vivo validations of Neo-7 biological functions; In vivo anti-tumor activity of Neo-7-Fc fusion protein in MC38 syngeneic models |
| 肿瘤浸润淋巴细胞分析 | 肿瘤消化条件（670 µg/mL胶原酶IV，2 µg/mL DNase I），染色抗体组合，固定/透化条件（4% PFA，0.1%皂苷） 阅读提示：Materials and methods: Tumor-infiltrating leukocytes (TILs) analysis |
| RNA测序 | 治疗剂量（10 mg/kg），分离CD8+ T细胞试剂盒，TRIzol裂解，RNA测序平台（未注明） 阅读提示：Materials and methods: RNA sequencing of splenic CD8+ T-cells |