建立持续感染模型
确定IL2rg KO仓鼠能否建立SARS-CoV-2的持续感染。
IL2rg KO仓鼠（3-4月龄，雄性，n=4）经鼻内接种104 pfu XBB.1.16变异株，监测100天，定期采集口腔拭子并测定病毒滴度。
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SARS-CoV-2持续感染的仓鼠模型中的病理学和病毒进化动力学
Pathology and viral evolutionary dynamics in a hamster model of persistent SARS-CoV-2 infection.
实验完整度
高研究包含体内感染模型（IL2rg KO仓鼠和野生型仓鼠）、组织病理学分析、病毒滴度测定、深度测序及多种进化分析，涵盖不同证据层级。
主要模型
IL2rg基因敲除叙利亚仓鼠（雄性，3-4月龄） 野生型叙利亚仓鼠（雄性，2-3月龄） Vero E6 TMPRSS2-ACE2细胞
重点核对
IL2rg KO仓鼠经鼻内接种104 pfu XBB.1.16变异株 感染后第14天和第100天测定组织病毒滴度 口腔拭子样本在感染后第39、53、64、77、97天采集 野生型仓鼠经鼻内接种105 pfu病毒 深度测序使用ARTIC V5.3.2引物（口腔拭子）和QIAseq COVID Panel（组织样本）
摘要
SARS-CoV-2感染通常在数周内消退，但罕见的长期复制病例——有时超过一年——已被记录，特别是在免疫功能低下的个体中。这些持续感染构成健康风险，并可能产生高度分化的变异株，但其潜在生物学仍知之甚少。在此，我们描述了一种使用缺乏白细胞介素-2受体γ亚基（IL2rg）的转基因叙利亚仓鼠（雄性）的SARS-CoV-2持续感染模型。感染XBB.1.16变异株后，感染两周内病毒在呼吸组织中高效复制，并传播到其他部位，包括肠道。在感染后100天，多个组织中的病毒滴度仍然很高。纵向口腔拭子测序揭示了宿主内单核苷酸变异（iSNV）频率的动态变化，iSNV群组共同上升和下降，与强烈的遗传连锁一致。同义和非同义突变以相似速率积累，表明遗传漂变是主要的进化力量。组织和拭子来源的序列揭示了广泛的宿主内多样性，并提示了组织特异性的进化轨迹。该模型能够详细研究SARS-CoV-2的持续性和宿主内病毒进化，并提供一个受控系统来研究组织储存库中的长期复制如何促进病毒多样化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2在免疫功能低下的宿主中持续感染的病理学和宿主内病毒进化动力学是怎样的？
- 核心机制
- 在缺乏功能性T细胞、B细胞和自然杀伤细胞的IL2rg KO仓鼠中，SARS-CoV-2持续复制，病毒进化主要由遗传漂变驱动，而非自然选择。
- 主要证据
- 在感染后100天，多个组织（肺、鼻甲、肠道等）中检测到高滴度传染性病毒；纵向口腔拭子测序显示iSNV频率动态波动，同义和非同义突变积累速率相似，NS/S比率与中性进化预期一致。
- 研究意义
- IL2rg KO仓鼠模型为研究SARS-CoV-2持续性、组织储存库在病毒进化中的作用以及评估清除病毒储存库的抗病毒治疗策略提供了受控系统。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估病毒组织分布和病理学
确定病毒在持续感染期间的組織分布和病理学特征。
在感染后第14天和第100天，收集多种组织（肺、鼻甲、肝、十二指肠、空肠、回肠、心、脾、肾、脑等），通过空斑实验测定病毒滴度，并使用免疫组织化学和原位杂交检测病毒抗原和RNA，同时进行H&E染色和Iba1免疫组化评估组织病理。
比较病毒在野生型仓鼠中的复制能力
确定从持续感染仓鼠分离的病毒是否获得了增强的复制表型。
野生型叙利亚仓鼠（2-3月龄，雄性，n=4/组）经鼻内接种105 pfu原始XBB.1.16分离株或来自仓鼠#3肺组织的病毒，在感染后第3天和第6天收集呼吸组织测定病毒滴度，并监测体重变化14天。
分析宿主内病毒进化动态
描述持续感染期间病毒在宿主内的进化动态和机制。
对病毒接种物、口腔拭子和组织样本进行深度测序，使用ARTIC V5.3.2引物（MiSeq平台）和QIAseq COVID Panel（NovaSeq 6000平台）。分析iSNV频率、突变类型、NS/S比率、Bray-Curtis相似性和Jaccard层次聚类。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
病毒滴定
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒滴定 | Vero E6 TMPRSS2-ACE2细胞 | -- | -- |
| 细胞培养 | 达尔伯克改良伊格尔培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 遗传霉素（G418） | Invivogen | -- | |
| 重组蛋白表达 | 嘌呤霉素 | Invivogen | -- |
| 组织病理学 | RNA scope 2.5 HD红色检测试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | -- |
| 免疫组织化学 | 兔单克隆抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗体 | Sino Biological | 40143-R001 |
| 抗Iba1抗体 | GenTex | GTX100042 | |
| Dako Envision系统 | Dako | K4001 | |
| RNA提取 | 病毒RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| PureLink RNA小提试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA测序 | QIAseq DIRECT SARS-CoV-2试剂盒 | Qiagen | -- |
| COVIDSeq检测试剂盒 | Illumina | -- | |
| Illumina MiSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与病毒感染 | IL2rg KO仓鼠（雄性，3-4月龄）经鼻内接种XBB.1.16变异株，剂量为104 pfu；野生型仓鼠（雄性，2-3月龄）接种105 pfu。 阅读提示：Methods：Experimental infection and sample collection of hamsters |
| 病毒滴度测定 | 组织样本（肺、鼻甲、肝、肠道等）在感染后第14天和第100天收集；使用Vero E6 TMPRSS2-ACE2细胞进行空斑实验。 阅读提示：Methods：Cells and viruses; Figure 1 legend |
| 组织病理学分析 | 使用免疫组织化学检测病毒核衣壳蛋白和Iba1，原位杂交检测病毒RNA；H&E染色评估组织病理。 阅读提示：Methods：Histopathology |
| 病毒基因组测序 | 口腔拭子测序使用ARTIC V5.3.2引物和Illumina MiSeq；组织测序使用QIAseq DIRECT SARS-CoV-2 Kit和Illumina NovaSeq 6000。 阅读提示：Methods：SARS-CoV-2 genome sequencing |
| 进化分析 | iSNV调用阈值：最小频率3%，最小读深度200×；使用nf-core viral-recon流程v2.6.0处理数据。 阅读提示：Methods：Processing raw Illumina data |