临床样本收集与抗体效价检测
评估AOID患者血浆中IFN-γ结合和中和抗体的水平及动态变化
收集22例AOID患者外周血，通过ELISA和基于THP-1细胞的中和试验检测血浆AIGA结合和中和效价，并对患者A01进行纵向随访。
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成人发病免疫缺陷中产生IFN-γ中和自身抗体的骨髓浆细胞的鉴定与特征分析
Identification and characterization of bone marrow plasma cells producing IFN-γ-neutralizing autoantibodies in adult-onset immunodeficiency.
实验完整度
高包含患者样本的抗体筛选、体外中和功能验证、SPR竞争实验、结构解析和单细胞转录组分析等多个独立证据层级。
主要模型
THP-1细胞系 健康供者PBMC来源的单核细胞 成人发病免疫缺陷患者骨髓浆细胞 游离293F细胞
重点核对
患者A01、A18、A19的骨髓样本采集时间点（分别为入组后第76、4、1周） 中和抗体的IC50值（0.04-0.33 μg/mL）及对照组emapalumab的IC50值（0.06 μg/mL） SPR竞争实验中使用的IFN-γR1 F05突变体以增强IFN-γR2结合 单细胞RNA测序分析的细胞数量（A01:488, A18:2061, A19:951） 结构解析中A01BM-03 Fab与IFN-γ复合物的分辨率（3.02 Å）
摘要
Wang等人鉴定出成人发病免疫缺陷患者骨髓中的IFN-γ特异性抗体分泌细胞（ASCs），揭示了致病性抗IFN-γ自身抗体发挥功能的结构基础，并支持靶向ASC治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 成人发病免疫缺陷患者在接受利妥昔单抗治疗后，循环自身抗体水平为何仍持续存在？
- 核心机制
- IFN-γ特异性中和抗体通过竞争性阻断IFN-γ与IFN-γR1或IFN-γR2的结合，抑制JAK-STAT1信号通路；其中A01BM-03通过结合IFN-γ二聚体上的四级构象表位，对IFN-γR2结合位点产生空间位阻。
- 主要证据
- 从患者骨髓ASC中分离出23种IFN-γ特异性单克隆抗体，其中6种具有中和活性，通过SPR竞争实验和晶体结构分析证实其阻断受体结合机制。
- 研究意义
- 研究结果为骨髓中IFN-γ特异性ASC的存在提供了直接证据，支持靶向ASC治疗以恢复AOID患者免疫稳态的新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
骨髓ASC的分离与单细胞克隆
从骨髓中直接分离IFN-γ特异性抗体分泌细胞并获取其抗体基因序列
利用MoSMAR芯片和scRNA-seq技术，从3例AOID患者的骨髓浆细胞中分离IFN-γ特异性ASC，通过单细胞抗体基因扩增表达获得单克隆抗体。
中和活性筛选与功能验证
评估所获抗体对IFN-γ介导的JAK-STAT1信号及巨噬细胞活化的抑制效果
通过THP-1细胞中和试验评估单抗抑制STAT1磷酸化的能力，并在THP-1衍生巨噬细胞和健康供者单核细胞中检测对IFN-γ诱导的CD80、HLA-ABC、iNOS、HLA-DR和CXCL10表达的影响。
竞争性结合分析
明确中和抗体靶向的IFN-γ表位及其与受体结合的竞争关系
采用SPR竞争实验，将22种单抗与IFN-γ受体（IFN-γR1和IFN-γR2）竞争结合IFN-γ，并分析抗体间的竞争模式。
结构解析
从原子水平阐明中和抗体的作用机制
解析A01BM-03 Fab与IFN-γ二聚体复合物的晶体结构，并进行丙氨酸扫描突变验证关键结合残基。
单细胞转录组分析
在转录水平鉴定IFN-γ特异性ASC的细胞亚群及其克隆扩增特征
对骨髓浆细胞进行5'端scRNA-seq，无监督聚类鉴定8个细胞簇，分析IFN-γ特异性ASC的定位及克隆扩增情况，并评估CD11c和ZEB2等ABC标记基因的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体检测 | Alexa Fluor 568标记抗人IgG（H+L）抗体 | Invitrogen | A21090 |
| ELISA | HRP标记抗人IgG（H+L）抗体 | Promega | W4031 |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| SMM 293-TII表达培养基 | Sino Biological | -- | |
| 蛋白纯化 | Strep-Tactin XT树脂 | -- | -- |
| 镍-次氮基三乙酸树脂 | -- | -- | |
| Superdex 200 Increase色谱柱 | Cytiva | -- | |
| 蛋白表达 | FreeStyle 293F细胞 | Thermo Fisher Scientific | R79007 |
| 细胞系 | THP-1细胞 | ATCC | TIB-202 |
| NIH/3T3-huCD40L细胞 | Provided by Dr. Hai Qi | -- | |
| 中和试验 | 重组人IFN-γ | R&D | 285-IF/CF |
| 佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯 | Beyotime | S1819 | |
| 脂多糖 | Beyotime | S1735 | |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| AF647标记的磷酸化STAT1 (pY701)抗体 | BioLegend | 666410 | |
| 流式分析 | Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液 | Cytiva | 17144002 |
| Zombie UV可固定活力染料 | BioLegend | 423107 | |
| PE/Cyanine7标记抗人CD14抗体 | BioLegend | 301813 | |
| FITC标记抗人HLA-DR抗体 | BioLegend | 307604 | |
| ELISA | 人IP-10预包被ELISA试剂盒 | Dakewe | 1117452 |
| 细胞分选 | 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi | 130-090-101 |
| 人浆细胞分离试剂盒II | Miltenyi | 130-093-628 | |
| CD138微磁珠 | Miltenyi | 130-097-614 | |
| B细胞永生化 | 重组人IL-2蛋白 | Sino Biological | 11848-HNAH1-E |
| 重组人IL-21蛋白 | Sino Biological | 10584-HNAE | |
| 单细胞RNA测序 | SeekOne DD单细胞5'文库制备试剂盒 | SeekGene | K00501 |
| SeekOne DD单细胞V(D)J富集试剂盒（人BCR） | SeekGene | K00701 | |
| VAHTS DNA纯化磁珠 | Vazyme | N411-01 | |
| SPR | CM5传感芯片 | Cytiva | 29104988 |
| Biacore 8K+ | Cytiva | -- | |
| 结构解析 | 内蛋白酶Lys-C | Roche | 11047825001 |
| 蛋白A琼脂糖树脂 | GenScript | -- | |
| 测序平台 | NovaSeq 6000 | Illumina | -- |
| 流式分析 | BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| Moflo Astrios EQ流式细胞仪 | Beckman | -- | |
| BD FACSDiscover S8细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 患者A01、A18、A19的骨髓样本采集时间点（分别为入组后第76、4、1周） 阅读提示：STAR Methods - Study approval and patient samples |
| 抗体中和活性检测 | IFN-γ浓度（200 ng/mL）、抗体起始浓度（50 μg/mL）、THP-1细胞数量（1×10^5）及刺激时间（15分钟） 阅读提示：STAR Methods - Neutralizing assay using THP-1 cells |
| SPR竞争实验 | IFN-γR1竞争实验使用可溶性IFN-γR1；IFN-γR2竞争实验使用IFN-γR1 F05突变体增强复合物稳定性 阅读提示：STAR Methods - Competitive analysis by SPR |
| 结构解析 | A01BM-03 Fab与IFN-γ复合物的结晶条件：0.1 M Bis-Tris pH 7.0和22% PEG 1500；数据收集波长0.9792 Å 阅读提示：STAR Methods - Crystallization and structural determination |