AUTOTAR病毒的构建与筛选
构建携带条件可移除自噬靶向基序（ATM）的甲型流感病毒，并筛选能够成功生成的病毒株。
将ATM通过TEVcs连接至甲型流感病毒多个蛋白（PB2、PB1、PA、NP、M1、NS1）的N端或C端，共转染至HEK293T-TEVp和MDCK-TEVp共培养细胞中，观察细胞病变效应，确定NS1-NATM可成功产生病毒，并通过TCID50检测病毒滴度。
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生成自噬靶向甲型流感病毒作为减毒活疫苗
Generation of an autophagy-targeting influenza A virus as live attenuated vaccine.
实验完整度
高包含体外细胞实验（自噬机制验证、荧光共定位、免疫共沉淀）、体内小鼠模型（安全性和保护性实验）以及蛋白质结构预测等多层级证据，功能验证和机制验证完整。
主要模型
MDCK-TEVp细胞 HEK293T细胞 HeLa细胞 C57BL/6J小鼠
重点核对
病毒构建中ATM和TEVcs的插入位置：NS1蛋白的N端或C端 病毒滴度检测方法：TCID50 assay
摘要
尽管已有疫苗，流感仍然是重大的公共卫生负担，这凸显了对具有更高安全性和有效性的疫苗策略的需求。在此，我们通过利用宿主细胞的自噬机制来操纵病毒蛋白降解，开发了一种自噬靶向甲型流感病毒作为减毒活疫苗。该病毒通过在病毒基因组中引入一个条件性可移除的自噬体靶向基序而生成，该基序在常规细胞中通过自噬介导的标记病毒蛋白降解实现病毒减毒，同时允许在工程细胞系中进行高效复制以用于大规模生产。该工程病毒在体内高度减毒，但能够诱导强大的体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫应答，并对同源和异源病毒攻击提供完全的交叉反应保护。总之，这项研究确立了自噬介导的蛋白降解作为一种调节病毒减毒的可行策略，该策略可适用于针对其他病原体的减毒活疫苗的合理设计。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过利用宿主自噬机制条件性降解病毒蛋白，开发一种安全有效的减毒活流感疫苗？
- 核心机制
- 通过将自噬靶向基序（ATM）融合至病毒NS1蛋白，使该蛋白在常规细胞中被自噬途径选择性降解，从而抑制病毒复制；而在表达TEV蛋白酶（TEVp）的细胞中，TEVcs被切割去除ATM，蛋白得以稳定，病毒得以高效复制。
- 主要证据
- 体外实验证明NS1-NATM蛋白依赖自噬降解，包括自噬抑制剂处理、ATG8敲除细胞和免疫共沉淀实验；体内实验证明NS1-NATM在小鼠中高度减毒，并能诱导全面的免疫应答和交叉保护。
- 研究意义
- 确立了自噬介导的蛋白降解作为调节病毒减毒的可行策略，为设计针对其他病原体的减毒活疫苗提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外减毒机制验证
验证NS1-NATM病毒的NS1蛋白降解依赖于自噬途径，且由ATM介导。
使用自噬抑制剂（BafA1、CQ）和蛋白酶体抑制剂（MG132）处理表达NS1-NATM的HEK293T细胞，检测蛋白水平变化；在ATG8敲除HeLa细胞中检测NS1-NATM蛋白水平；通过免疫共沉淀和免疫荧光实验检测NS1-NATM与ATG8蛋白的相互作用及共定位；使用蛋白合成抑制剂CHX追踪蛋白降解动力学。
体内安全性评估
评估NS1-NATM病毒在体内的减毒程度和长期安全性。
将C57BL/6J小鼠经鼻内感染10^5 TCID50的NS1-NATM或WT病毒，监测小鼠存活率、体重变化、肺部病毒载量和组织病理学变化，持续3个月；同时检测病毒脱落情况。
免疫原性评估
评估NS1-NATM疫苗诱导的体液、黏膜和细胞免疫应答水平。
通过鼻内或肌肉途径接种NS1-NATM疫苗（10^5 TCID50），在不同时间点采集血清、支气管肺泡灌洗液、肺和脾脏样本，检测HI抗体、NT抗体、IgG、IgA抗体以及NP特异性T细胞反应。
保护效力评估
评估NS1-NATM疫苗对同源和异源流感病毒攻击的保护效果。
免疫后3周或6个月，用同源WSN（H1N1）或异源A/HK/68（H3N2）病毒攻击小鼠，监测存活率、体重变化和肺部病毒载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | Cat# c11995500BT |
| 胎牛血清 | PAN | Cat# ST30-3302 | |
| 嘌呤霉素 | InvivoGen | Cat# ant-pr-1 | |
| 病毒制备 | TransIT-X2动态递送系统 | Mirus | Cat# MIR6003 |
| TPCK处理的胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | Cat# T1426-50MG | |
| Western blot | 抗Flag抗体 | Proteintech Group | Cat# 20543-1-AP |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech Group | Cat# HRP-60008 | |
| 抗LC3B抗体 | CST | Cat# 2775S | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | 7Sea Biotech | Cat# P001-3 |
| Western blot | Immunobilon Western化学发光HRP底物 | Proteintech Group | Cat# PK10001 |
| qRT-PCR | 细胞/组织总RNA提取试剂盒 | Vazyme | Cat# RC112-01 |
| HiScript III逆转录预混液（qPCR）试剂盒 | Vazyme | Cat# R323-01 | |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Cat# Q712-02 | |
| 荧光成像 | 玻璃底共聚焦培养皿 | Cellvis | Cat# D35-20-1.5-N |
| 抗HA抗体 | MBL | Cat# M180-3 | |
| Alexa Fluor 555偶联的山羊抗小鼠IgG | Life Technologies | Cat# A32727 | |
| DAPI染色液 | Invitrogen | Cat# 2086723 | |
| ELISA | 重组HA蛋白 | Sino Biological | Cat# 11692-V08H |
| 重组NP蛋白 | Sino Biological | Cat# 11675-V08B | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体 | Proteintech | Cat# SA00001-1 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgA抗体 | Abcam | Cat# ab97235 | |
| TMB底物溶液 | Beyotime | Cat# P0209 | |
| ELISA终止液 | Solarbio | Cat# C1058 | |
| ELISA包被缓冲液 | Solarbio | Cat# C1055 | |
| 96孔酶标板 | Corning | Cat# 3590 | |
| ELISpot | 干扰素-γ酶联免疫斑点检测试剂盒 | Mabtech | Cat# 3321-4AST-2 |
| 生物素化抗小鼠IFN-γ检测抗体 | MABTECH | Cat# 3321-6 | |
| 链霉亲和素-碱性磷酸酶 | MABTECH | Cat# 3310-10 | |
| 碱性磷酸酶底物BCIP/NBT-Plus | MABTECH | Cat# 3650-10 | |
| HI assay | 受体破坏酶溶液 | Denka Seiken | Cat# 340122 |
| 蛋白降解实验 | 巴弗洛霉素A1 | -- | -- |
| 氯喹 | -- | -- | |
| MG132 | -- | -- | |
| 动物实验 | 硼替佐米 | -- | -- |
| 三溴乙醇 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒构建 | ATM和TEVcs的插入位置（NS1蛋白N端） 阅读提示：Methods: Generation of influenza viruses and vaccine |
| 细胞培养 | MDCK-TEVp和HEK293T-TEVp细胞系的构建与培养条件 阅读提示：Methods: Cells |
| 病毒扩增 | 使用MDCK-TEVp细胞扩增病毒，维持液中TPCK-胰蛋白酶浓度（2 μg/mL） 阅读提示：Methods: Generation of influenza viruses and vaccine |
| 病毒滴度测定 | TCID50 assay的具体操作和计算（MDCK-TEVp细胞，96孔板，孵育4天） 阅读提示：Methods: Median tissue culture infectious dose (TCID50) assay |
| 动物实验 | 小鼠品系（C57BL/6J）、年龄（6-8周）、性别（雌性）、接种剂量（10^5 TCID50）和途径（鼻内或肌内） 阅读提示：Methods: Analysis of in vivo safety, Evaluation of immunogenicity and protection efficacy |