表征基因表达ITH景观
评估iCCA中基因表达ITH的程度及来源。
利用多区域采样队列的RNA-seq数据进行层次聚类和异质性评分，分析ITH与肿瘤纯度、免疫评分、基质评分的相关性，并模拟不同采样数量对ITH的影响。
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肝内胆管癌中靶向肿瘤内异质性的稳健转录组学标志物
Robust transcriptomic hallmarks targeting intratumor heterogeneity in intrahepatic cholangiocarcinoma.
实验完整度
高整合多区域、单区域、单细胞RNA测序队列及多组学数据，结合细胞系、类器官、小鼠模型和患者样本，进行了功能验证（如CXCL5敲低/过表达、体内治疗实验）和机制验证（如免疫逃逸、HSP90抑制）。
主要模型
多区域采样iCCA队列（205个肿瘤亚区域，45例患者） Fu-iCCA队列（n=255） HRA004766队列（n=116） KRAS/Trp53小鼠iCCA模型（KTP） iCCA患者来源类器官
重点核对
多区域采样iCCA队列（OEP002560）的RNA-seq数据，含205个肿瘤亚区域，45例患者 LIHV基因集（n=1341）的筛选标准：intertumor heterogeneity高于均值且位于回归线95%置信区间以下 亚型分类基于LIHV基因集层次聚类，使用四个独立iCCA队列（Fu、HRA004766、OEP002768、GSE89749） CXCL5功能实验：HuCCT1和RBE细胞系敲低/过表达，transwell迁移实验，KTP小鼠皮下模型（n=6/组） 治疗实验：KRAS/p19模型（n=5/组）和KRAS/Trp53模型（n=6/组），anti-PD1、alvespimycin或组合，腹腔注射，KRAS/p19治疗2周，KRAS/Trp53治疗3周
摘要
肿瘤内异质性（ITH）限制了肝内胆管癌（iCCA）的精准肿瘤学实践。Lin等人表明，肿瘤微环境变异驱动基因表达异质性，并建立了不依赖于ITH的转录组分类，该分类与不同的临床结局、分子特征、免疫微环境、治疗脆弱性及亚型特异性诊断生物标志物相关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何克服基因表达肿瘤内异质性对肝内胆管癌分子分型的影响，建立稳健的分类系统并识别亚型特异性生物标志物和治疗策略？
- 核心机制
- 肿瘤微环境中的免疫和基质细胞变异是基因表达异质性的主要驱动因素；CXCL5由肿瘤细胞和巨噬细胞分泌，招募中性粒细胞，促进炎症性亚型的肿瘤进展和炎症微环境形成。
- 主要证据
- 多区域转录组分析显示免疫和基质标记基因异质性高；LIHV基因集在四个队列中定义五个亚型，且只有一个患者亚区分类不一致；CXCL5过表达增加中性粒细胞迁移和肿瘤生长（体内外实验）；HSP90抑制联合anti-PD1在炎症性模型中显著减少肿瘤负荷。
- 研究意义
- 研究提供了不依赖ITH的分子分类框架，为iCCA的精准治疗提供潜在的生物标志物（GPRC5A、VTCN1、血清CEA、CA19-9）和治疗策略（HSP90抑制剂联合免疫治疗），并可能适用于其他癌症的转录组分类和生物标志物发现。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估ITH对现有分子分型和预后模型的影响
检验现有转录组分型方法和预后signature在ITH背景下是否稳健。
将8种已发表的iCCA转录组分型方法和7种预后signature应用于多区域队列，计算不一致率，并绘制聚类一致性曲线。
鉴定LIHV基因集
识别具有低瘤内异质性且高瘤间变异性的基因，用于稳健分类。
在基因层面绘制ITG比ITH的散点图，通过分位数回归和置信区间筛选LIHV基因，并评估其表达分布、通路富集、拷贝数变化和蛋白相关性。
建立ITH不敏感的分子分类
定义稳健的iCCA分子亚型并验证其临床和分子特征。
使用LIHV基因集对四个独立iCCA队列进行层次聚类，定义五个亚型，并比较临床特征、生存、基因突变、CNV、通路活性。
分析亚型免疫微环境
探究各亚型的免疫细胞浸润和免疫特征差异。
利用TIMER2.0和Danaher等算法估算免疫细胞丰度，并通过免疫组化验证中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞等。此外，分析CXCL5与中性粒细胞浸润的相关性，并进行体外迁移实验和体内小鼠模型验证。
评估亚型特异性治疗靶点
识别不同亚型对药物和免疫治疗的反应性。
利用iCCA类器官药物筛选数据，预测免疫治疗敏感性，并使用KTP细胞和HTVI小鼠模型进行体内治疗实验，包括HSP90抑制剂和anti-PD1、anti-TIM3。
筛选亚型特异性生物标志物
识别可用于临床诊断的免疫组化和血清标志物。
通过监督分析在LIHV基因集中筛选SI和SIII特异性基因，利用免疫组化验证H-score，并通过ROC曲线评估诊断价值。同时评估血清CEA和CA19-9的诊断效能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组化 | 抗CD66b抗体 | Abcam | ab197678 |
| 抗CD68抗体 | Cell Signaling Technology | 76437 | |
| 抗CD3抗体 | Abcam | ab16669 | |
| 抗CD20抗体 | Abcam | ab9475 | |
| 抗αSMA抗体 | Servicebio | GB111364 | |
| 抗CK19抗体 | Servicebio | GB12197 | |
| 抗GPRC5A抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-390263 | |
| 抗S100P抗体 | Servicebio | GB113949 | |
| 抗CEACAM5抗体 | Bioass | bsm-43141M | |
| 抗SERPINB5抗体 | Servicebio | GB111040 | |
| 抗PSCA抗体 | Bioass | bs-0669R | |
| 抗MSLN抗体 | Servicebio | GB111016 | |
| 抗VTCN1抗体 | Abmart | PK03217 | |
| 抗FXYD2抗体 | Abmart | PH9090 | |
| 抗CHST9抗体 | Bioass | bs-13940R | |
| 抗ANXA9抗体 | Servicebio | GB114601 | |
| 抗DCDC2抗体 | Bioass | bs-11824R | |
| 抗ZBTB20抗体 | Abmart | PHA9198 | |
| Western blot | 抗CXCL5抗体 | R&D Systems | AF254 |
| 抗CXCL5抗体 | Abmart | PH9257 | |
| 抗GAPDH抗体 | Servicebio | GB11002 | |
| 动物实验 | 抗小鼠PD-1抗体 | Selleck | A2122 |
| IgG2a同型对照 | Selleck | A2123 | |
| 流式细胞术 | FVD APC/CY7 | eBioscience | 65-0865-14 |
| CD45 AF700 | BioLegend | 109822 | |
| CD11b BV510 | BioLegend | 101263 | |
| Ly6G FITC | BioLegend | 127605 | |
| CD45 PE/Cy5 | BioLegend | 304009 | |
| CD66b APC | BioLegend | 305117 | |
| 细胞培养 | 重组人EGF | Peprotech | PHG0311 |
| 药物处理 | Ganetespib | Selleck | S1159 |
| Alvespimycin | Selleck | S1142 | |
| TAE684 | Selleck | S1108 | |
| ABT-263 | Selleck | S1001 | |
| dBET6 | Selleck | S8762 | |
| 免疫组化 | EDTA缓冲液 | Servicebio | G1203 |
| 柠檬酸盐缓冲液 | Servicebio | G1202 | |
| 内源性过氧化物酶阻断液 | YIFAN Biological | YFH4001 | |
| 山羊血清 | BOSTER | AR0009 | |
| 蛋白提取 | 裂解缓冲液 | Biosharp | BL504A |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Yeasen | 20124ES | |
| 磷酸化蛋白酶抑制剂混合物 | Yeasen | 20109ES | |
| 细胞消化 | IV型胶原酶 | BioFroxx | 2091GR001 |
| 类器官培养 | 基质胶 | Corning | 356231 |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | 12634010 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15070063 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| B-27补充剂 | Gibco | 17504044 | |
| N-2补充剂 | Gibco | 17502048 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | A9165 | |
| R-spondin 1 | Sino Biological | 11083-HNAS | |
| Noggin | Sino Biological | 50688-M02H | |
| 烟酰胺 | Sigma | N0636 | |
| 胃泌素 | Sigma | G9145 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15-500 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26-25 | |
| 毛喉素 | MedChemExpress | HY-15371 | |
| Y27632 | Selleck | S1049 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604021 | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒(CCK-8) | Yeasen | 40203ES76 |
| 中性粒细胞分离 | 人外周血中性粒细胞分离试剂盒 | Solarbio | P9040 |
| RNA提取 | MolPure TRIeasy Plus总RNA试剂盒 | Yeasen | 19211ES |
| cDNA合成 | Hifair III第一链cDNA合成SuperMix | Yeasen | 11141ES |
| qPCR | Hieff qPCR SYBR Green Master Mix | Yeasen | 11202ES |
| 蛋白电泳 | All-in-One Tricine-PAGE试剂盒 | Epizyme Biomedical Technology | PG310 |
| 蛋白定量 | Omni-Easy即用型BCA蛋白定量试剂盒 | Epizyme Biomedical Technology | ZJ102 |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000001 |
| RNA提取 | RNAmini试剂盒 | Qiagen | 74536 |
| 质粒构建 | PGMLV-CMV-Mouse_Cxcl5-3×Flag-PGK-Puro | Genomeditech, Shanghai | -- |
| PGMLV- PGK-Puro | Genomeditech, Shanghai | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 转录组异质性分析 | Lin's iCCA队列（多区域采样）的RNA-seq数据来源和预处理方法，基因表达异质性的计算方法和参数（如FPKM阈值、VST归一化） 阅读提示：STAR Methods 中 'Quantification of RNA heterogeneity' |
| LIHV基因集鉴定 | 筛选LIHV基因的具体标准：intertumor heterogeneity高于均值且位于回归线95%置信区间以下；使用的分位数回归方法 阅读提示：STAR Methods 中 'Identification of the LIHV gene set' |
| 分子分型 | 四个iCCA队列（Fu、HRA004766、OEP002768、GSE89749）的数据来源、样本量、过滤标准；层次聚类使用的算法和参数 阅读提示：STAR Methods 中 'Molecular classification based on intratumor heterogeneity' |
| 免疫组化 | TMA的组织来源、样本量（179和209/222）、抗体克隆号及稀释比例、抗原修复方法、H-score量化标准 阅读提示：STAR Methods 中 'Tissue microarray' 和 'Immunohistochemistry and quantification' |
| CXCL5功能实验 | 细胞系（HuCCT1、RBE）、siRNA序列、转染试剂、中性粒细胞分离方法、Transwell孔径和培养时间、中性粒细胞定量方法 阅读提示：STAR Methods 中 'Cell transfection' 和 'Neutrophil migration assay' |
| 小鼠治疗实验 | 小鼠品系、周龄、性别、饲养条件；HTVI模型构建质粒和剂量；治疗药物、剂量、给药途径、频率和时间；分组样本量（n=5-8） 阅读提示：STAR Methods 中 'Animal experiments' |