确认LPS诱导人巨噬细胞ISGylation和ISG15表达
验证LPS是否能诱导人巨噬细胞中ISGylation和ISG15表达
用LPS（1 µg/mL）处理分化的THP-1巨噬细胞16或24小时，收集全细胞裂解液，通过Western blot检测ISG15和Actin。
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胞外脂多糖通过I型干扰素/Caspase-4/Gasdermin-D通路触发巨噬细胞释放未结合型干扰素刺激基因15（ISG15）蛋白
Extracellular Lipopolysaccharide Triggers the Release of Unconjugated Interferon-Stimulated Gene 15 (ISG15) Protein from Macrophages via Type-I Interferon/Caspase-4/Gasdermin-D Pathway.
实验完整度
中包含细胞培养、抑制剂处理、Western blot、LDH检测、免疫沉淀等体外实验，验证了LPS、IFN、Casp4、GSDMD在ISG15释放中的作用，但缺乏体内或患者样本验证。
主要模型
人THP-1单核细胞系分化巨噬细胞
重点核对
LPS浓度1 µg/mL或0.5 µg/mL处理 IFN-β浓度1000 U/mL或500 U/mL处理 GSDMD抑制剂Disulfiram浓度30 µM Caspase-4抑制剂Ac-LEVD-CHO浓度4 µM IFN通路抑制剂B18R浓度0.25 µg/mL
摘要
干扰素刺激基因15（ISG15）是一种干扰素诱导的泛素样蛋白，在抗病毒防御和炎症反应中发挥重要作用，主要通过ISGylation过程实现，即ISG15共价结合到靶蛋白上。除其胞内功能外，在感染和癌症等疾病中，部分游离的未结合型ISG15也会释放到细胞外环境中。已知胞外ISG15可调节免疫细胞活性和细胞因子产生。尽管ISG15具有免疫调节作用，但其从细胞释放的机制尚不清楚。在本研究中，我们确定了一种人巨噬细胞释放ISG15的非裂解性机制。以脂多糖（LPS）作为刺激物，我们证明胞外LPS通过利用质膜定位的Gasdermin D（GSDMD）孔触发未结合型ISG15的释放。机制上，LPS通过I型干扰素（IFN）的自分泌/旁分泌作用激活Caspase-4（Casp4），切割GSDMD的N端结构域，形成细胞表面GSDMD孔，从而在无裂解性细胞死亡的情况下允许未结合型ISG15的胞外释放。总之，我们的研究确定了IFN-Casp4-GSDMD轴是细胞释放未结合型ISG15的一种先前未被识别的非经典途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞释放未结合型ISG15的机制仍不清楚，本文旨在探索LPS刺激下人巨噬细胞释放ISG15的分子机制。
- 核心机制
- 胞外LPS通过TLR4诱导I型干扰素产生，IFN通过自分泌/旁分泌作用激活Caspase-4，进而切割GSDMD形成质膜孔，介导未结合型ISG15的非裂解性释放。
- 主要证据
- 使用人THP-1巨噬细胞，通过Western blot检测ISGylation和ISG15释放，使用抑制剂（DSF、LEVD、B18R）和LDH实验证明GSDMD、Caspase-4和IFN的必要性，且排除了细胞裂解和自噬的参与。
- 研究意义
- 首次阐明ISG15释放的非经典细胞机制，为理解胞外ISG15在感染和炎症中的免疫调节作用提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测LPS诱导的ISG15胞外释放
验证LPS是否刺激巨噬细胞释放未结合型ISG15到胞外，并排除细胞裂解
收集LPS处理细胞的培养基上清，通过TCA沉淀和Western blot检测胞外ISG15，同时检测上清中Actin和LDH活性以排除细胞裂解。
验证TLR4和GSDMD在ISG15释放中的作用
探究LPS介导的ISG15释放是否依赖TLR4和GSDMD
使用TLR4抑制剂TAK-242或GSDMD抑制剂Disulfiram预处理细胞，然后加LPS刺激，检测胞外ISG15和细胞存活率。
验证Caspase-4在GSDMD切割和ISG15释放中的作用
确认Caspase-4是否参与LPS诱导的GSDMD切割和ISG15释放
使用Caspase-4抑制剂Ac-LEVD-CHO预处理细胞，加LPS刺激，检测胞外ISG15、GSDMD切割和细胞存活率。
验证I型干扰素在LPS介导ISG15释放中的作用
探究IFN的自分泌/旁分泌作用是否参与LPS诱导的ISG15释放
使用IFN通路抑制剂B18R或JAK抑制剂Ruxolitinib预处理细胞，加LPS刺激，检测ISGylation、GSDMD切割和胞外ISG15；同时用IFN-β直接处理细胞，验证其对ISG15释放的作用。
排除自噬在LPS介导ISG15释放中的作用
验证自噬是否参与LPS诱导的ISG15释放
使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3MA）预处理细胞，加LPS刺激，检测胞外ISG15。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco-ThermoFisher Scientific | 11875093 |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞分化 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞处理 | 脂多糖 | InvivoGen | tlrl-3pelps |
| 干扰素-β | Sino Biological | 10704-HNAS | |
| 双硫仑 | MedChemExpress | HY-B0240 | |
| Ac-LEVD-CHO | Santa Cruz Biotechnology | 396109 | |
| B18R蛋白 | InvivoGen | inh-b18r | |
| TAK-242 | MedChemExpress | HY-11109 | |
| 鲁索替尼 | MedChemExpress | HY-50856 | |
| 3-甲基腺嘌呤 | Sigma-Aldrich | 5142-23-4 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Western blot | ISG15抗体 | 文中未明确说明 | -- |
| Gasdermin D抗体 | Cell Signaling Technology | 39754S | |
| 肌动蛋白抗体 | Bethyl Laboratories | A300-491A | |
| 硝酸纤维素膜 | Amersham Protran-Cytiva | -- | |
| Western Lightning Plus-ECL化学发光系统 | PerkinElmer | 104001EA | |
| LDH检测 | LDH反应混合物 | abcam | ab65393 |
| 免疫沉淀 | 蛋白G琼脂糖珠 | ThermoFisher Scientific | 20398 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与分化 | THP-1细胞系来源（ATCC TIB-202），培养条件（RPMI-1640含10% FBS、100 IU/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、1 mM丙酮酸钠、10 mM HEPES、50 µM β-巯基乙醇），分化条件（100 nM PMA处理24小时）。 阅读提示：2.1 Cell Culture |
| 细胞处理 | LPS浓度（1 µg/mL或0.5 µg/mL），IFN-β浓度（1000 U/mL或500 IU/mL），抑制剂浓度和预处理时间（2小时），处理时间（未明确，需参考图注）。 阅读提示：2.2 Cell Treatment |
| 胞外蛋白检测 | TCA沉淀步骤（20% TCA，4℃过夜），Western blot检测ISG15和Actin。 阅读提示：2.4 TCA Precipitation, 图1B |
| 细胞毒性检测 | LDH实验步骤（上清离心8000 rpm 10分钟，按试剂盒说明操作，450 nm吸光度）。 阅读提示：2.5 Lactate Dehydrogenase (LDH) Assay |
| 免疫沉淀 | 蛋白G琼脂糖珠与ISG15抗体偶联过夜，免疫沉淀步骤（洗脱，Western blot检测）。 阅读提示：2.6 Immunoprecipitation |