序列收集与系统发育分析
汇集沙贝病毒RBD序列并分析其进化关系，为后续结合预测提供序列基础。
从NCBI和ZOVER数据库收集368条全长Spike序列，经质量筛选和去重后获得124个独特RBD序列，构建最大似然系统发育树并分为clade 1a、1b和2。
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RAISE：评估沙贝病毒溢出潜力的计算工具
RAISE: A computational tool for evaluating sarbecovirus spillover potential.
实验完整度
高包含序列分析、BLI结合实验、假病毒侵染实验、结构预测、突变筛选和深度突变扫描数据验证等多重证据层，并进行了功能验证和机制分析。
主要模型
HEK293T/HEK293A细胞 SARS-CoV-2假病毒系统 沙贝病毒RBD蛋白 蝙蝠ACE2直系同源物
重点核对
RBD-hACE2相互作用的RAISE评分阈值（F-I评分> -7.189，A-I评分> 0.328） BLI实验中使用500 nM ACE2进行结合筛选 假病毒实验中使用的细胞系HEK293T-AT和HEK293A-AT 关键突变位点（L455, F486, Q493, S494, Q498, N501）的突变扫描 曲妥珠单抗（Spike S2）用于Western blot验证
摘要
动物沙贝病毒，即SARS-CoV或SARS-CoV-2的近缘病毒，因其结合人ACE2（hACE2）受体的能力而构成显著的人畜共患威胁。为了应对评估这些威胁的挑战，我们开发了RAISE（受体结合域-hACE2相互作用评分评估），这是一个整合结构预测与相互作用评分的计算框架。通过对预测的hACE2相互作用进行评分，我们的RAISE模型将沙贝病毒分为三类：高潜力（hACE2结合）、可忽略潜力（hACE2不结合）和中间“ poised ”状态（定义为弱结合活性或具有高进化潜力的状态）。使用RAISE对两种“ hACE2-poised ”沙贝病毒PDF-2370和Khosta-1进行突变筛选，揭示了诸如T498Y/W等突变能够启用人类ACE2的利用，并扩展了它们与更广泛物种ACE2受体结合的能力。该模型的泛化能力通过前瞻性应用于mersbecoviruses得到进一步证明，突显了其在不同冠状病毒谱系中预先评估人畜共患威胁的实用性。RAISE为优先处理高风险病毒和指导大流行防范提供了预测性路线图。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何预测不同沙贝病毒结合人ACE2的潜力并识别可能获得人受体利用能力的病毒？
- 核心机制
- 沙贝病毒RBD与hACE2的结合能力取决于关键残基的相互作用，单点突变（如T498Y/W，K493Y）可增强结合并扩展物种嗜性，同时可能保留原始宿主结合能力。
- 主要证据
- 基于BLI实验的30个结合和24个不结合RBD的假病毒侵染数据，RAISE模型准确分类；突变筛选和功能实验证实了预测的突变（如PDF-2370的T498W/F/Y和Khosta-1的K493Y）赋予hACE2结合和假病毒进入能力，且与深度突变扫描数据一致。
- 研究意义
- RAISE可作为防御性工具，快速分类新型沙贝病毒并根据其与hACE2结合的预测能力，为优先高风险病毒和指导大流行防范提供路线图。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RBD表达与hACE2结合测定
实验测定不同沙贝病毒RBD与hACE2的结合能力，为模型训练和验证提供金标准。
表达并纯化111个RBD蛋白，通过生物层干涉（BLI）定性筛选（500 nM hACE2）和动力学测定（KD值），并用假病毒实验验证功能。
RAISE模型构建与验证
利用AlphaFold2结构预测和评分系统，建立预测RBD-hACE2结合潜力的计算模型。
使用AlphaFold2预测RBD-hACE2复合物结构（模板引导），计算F-I和A-I评分，通过k-means聚类（k=3）将病毒分为非结合、 poised 、结合三类；在测试集（72+2）和验证集（37）中验证。
突变筛选与功能验证
评估“ poised ”病毒获得hACE2结合能力的突变潜力，并验证模型预测。
对PDF-2370、Khosta-1和Rc-o319的六个关键残基（L455, F486, Q493, S494, Q498, N501）进行单点突变扫描（所有19种替换），选择评分最低的突变体进行BLI和假病毒实验验证。
结构与机制分析
解析突变增强hACE2结合的分子机制。
对结合突变体的RBD-hACE2复合物进行结构分析，计算FoldX能量项、界面接触和氢键等。
跨物种受体结合评估
评估突变对病毒宿主范围的影响。
使用BLI检测突变RBD与多种物种ACE2（蝙蝠、貉、鼬獾、小鼠等）的结合，并用假病毒实验验证进入能力。
验证与应用
验证RAISE模型的泛化能力，并测试其在新病毒受体预测中的适用性。
利用已发表的深度突变扫描数据（SARS-CoV-2、RaTG13、BtKY72）验证模型预测；将RAISE应用于mersbecoviruses的hDPP4利用预测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
序列分析与系统发育
结合动力学测定
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | DMEM高糖培养基 | Thermo Fisher Scientific | C11995500BT |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10091-148 |
| FreeStyle 293表达培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12338018 | |
| 转染 | 聚乙烯亚胺转染试剂 | Polysciences | 24765 |
| 蛋白纯化 | Protein A 琼脂糖 | Sino Biological | 10600-P07E-RN |
| 超滤管（10 kDa） | Merck Millipore | UFC901024 | |
| Strep-Tactin 磁珠 | Smart-Lifesciences | SA053100 | |
| 亲和素 | Thermo Fisher Scientific | 434401 | |
| D-生物素 | Thermo Fisher Scientific | B1595 | |
| SDS-PAGE | 一步法SDS-PAGE 15%凝胶制备试剂盒 | Vazyme | E305-C1 |
| 考马斯亮蓝快速染色液 | Genstar | ZE157-101S | |
| 一步法SDS-PAGE 8%凝胶制备试剂盒 | Vazyme | E302-C1 | |
| BLI | Octet RED96e 生物膜干涉仪 | Sartorius | -- |
| Octet ProA 生物传感器 | Sartorius | 18-5010 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A2058 | |
| Western blot | Spike S2抗体 | GeneTex | GTX632604 |
| 假病毒包装 | 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A1113803 |
| 博来霉素 | Thermo Fisher Scientific | R25001 | |
| 假病毒进入实验 | 荧光素酶检测系统 | Promega | E151A |
| 细胞培养裂解试剂 | Promega | E153A |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RBD表达与纯化 | 细胞系HEK293T的培养条件、转染试剂PEI MAX浓度、表达培养基更换时间和收集时间 阅读提示：Methods: RBD expression and purification |
| BLI结合测定 | RBD浓度（5 μg/mL）、ACE2浓度（500 nM）、结合和解离时间（120s/120s）、KD测定浓度系列 阅读提示：Methods: Bio-layer interferometry (BLI) assay |
| 假病毒包装与进入实验 | 质粒比例（psPAX2: pLVX-Luc-IRES-GFP: Spike = 4:3:5 μg）、转染试剂PEI MAX量、收获时间（60h）、细胞密度、感染时间 阅读提示：Methods: Pseudovirus assay |
| RAISE模型计算 | AlphaFold2参数（MSA 512/1024， recycling 3）、模板选择、评分阈值（F-I > -7.189, A-I > 0.328） 阅读提示：Methods: Prediction of potential binding conformations; Predicted interaction scores |