体内TAC模型建立及AMF治疗
评估AMF对压力超负荷诱导的心脏重塑的保护作用
对8周龄C57BL/6J小鼠实施TAC手术，术后连续6周每日腹腔注射AMF（10、25、50 mg/kg）或溶剂，以卡托普利为阳性对照，通过超声心动图、HE染色、WGA染色和天狼星红染色评估心脏功能、肥大和纤维化。
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穗花杉双黄酮，一种优先的TGF-β受体1抑制剂，通过调节TGF-β/Smad和MAPK信号通路减轻心脏重塑和功能障碍
Amentoflavone, a Preferentially TGF-β Receptor 1 Inhibitor, Alleviates Cardiac Remodeling and Dysfunction Through Modulating the TGF-β/Smad and MAPK Signaling Pathways.
实验完整度
高包含TAC小鼠模型、原代心肌细胞和心脏成纤维细胞体外实验，以及RNA-seq、分子对接、SPR和co-IP等多项机制验证。
主要模型
TAC诱导的压力超负荷小鼠模型 新生大鼠心室肌细胞（NRVMs） 新生大鼠心脏成纤维细胞（NRCFs）
重点核对
AMF给药剂量：25 mg/kg，腹腔注射，术后持续6周 体外AMF工作浓度：25 μM，处理24 h TAC手术：8周龄C57BL/6J小鼠，26G针头缩窄主动脉弓 阳性对照：卡托普利20 mg/kg/day腹腔注射 Ang II刺激浓度：20 μM，处理48 h
摘要
慢性心脏应激诱导心脏肥大和纤维化，从而促进病理性心脏重塑，这是心力衰竭的核心病理过程。穗花杉双黄酮（AMF）对几种心血管疾病具有有益的治疗作用；然而，其在病理性心脏重塑中的作用和潜在机制仍不清楚。在此，我们研究了AMF在横向主动脉缩窄（TAC）诱导的压力超负荷心脏中对病理性心脏重塑的保护作用。对由TAC引起的压力超负荷小鼠给予AMF治疗，并分析AMF对心脏功能、心脏肥大和纤维化的影响。使用RNA-seq、分子对接、表面等离子体共振（SPR）和co-IP来鉴定AMF的下游靶点。使用血管紧张素II（Ang II）和转化生长因子β1（TGF-β1）来表征AMF及其下游靶点在体外心脏肥大和纤维化中的作用。持续给予AMF显著抑制了TAC诱导的心脏重塑。与TAC模型小鼠相比，AMF处理的TAC模型小鼠的心脏/体重比、心肌细胞横截面积和肥大分子标志物显著降低。此外，AMF给药有效逆转了TAC诱导的肌成纤维细胞生成和细胞外基质沉积。在体外，AMF处理对心肌细胞肥大和心脏纤维化也获得了类似的结果。在机制上，AMF通过直接结合TGF-β受体1，阻断了TGF-β1的调节作用，并抑制了TGF-β/Smad和MAPK信号通路。这些结果表明，AMF通过结合TGF-β受体1，可能是病理性心脏重塑的一种有前景的治疗选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AMF在病理性心脏重塑中的作用及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- AMF直接结合TGF-β受体1（TβR1），阻断TGF-β1与TβR1的结合，抑制TGF-β/Smad和MAPK信号通路，从而减轻心脏肥大和纤维化。
- 主要证据
- 在TAC小鼠模型中，AMF显著改善心脏功能，降低心脏/体重比、心肌细胞横截面积及肥大和纤维化标志物表达；在NRVMs和NRCFs中，AMF逆转Ang II和TGF-β1诱导的肥大和纤维化；分子对接、SPR和co-IP证实AMF与TβR1直接结合并抑制TGF-β1-TβR1相互作用。
- 研究意义
- AMF可能作为TβR1抑制剂，为病理性心脏重塑和心力衰竭提供有前景的治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外心肌细胞肥大和成纤维细胞纤维化模型
验证AMF对心肌细胞肥大和心脏纤维化的直接作用
分离并培养NRVMs和NRCFs，分别用Ang II（20 μM）和TGF-β1刺激诱导肥大和纤维化，并用AMF（25 μM）处理，通过免疫荧光、qRT-PCR、Western blot、EdU和CCK-8检测细胞面积、肥大和纤维化标志物表达及增殖。
转录组学分析
鉴定AMF处理的TAC心脏中的差异表达基因和富集通路
对TAC+AMF组和TAC+vehicle组小鼠心脏进行RNA-seq，使用DESeq2分析差异表达基因（fold change≥2，q<0.05），进行GO和KEGG通路富集分析，并用GSEA验证TGF-β信号通路。
信号通路验证
验证AMF对TGF-β/Smad和MAPK信号通路的影响
通过Western blot检测心脏组织和NRVMs中p-TβR1、p-Smad2/3、Smad7以及p-JNK、p-ERK、p-P38的表达，比较AMF处理和未处理组的差异。
竞争性实验
证明外源性TGF-β1能拮抗AMF的抑制作用，从而支持AMF通过抑制TGF-β信号发挥心脏保护作用
在Ang II诱导的NRVM肥大模型中，加入外源性TGF-β1，检测AMF对TGF-β/Smad和MAPK通路及肥大标志物的抑制作用是否被逆转。
靶点鉴定
验证AMF是否直接结合TβR1并抑制TGF-β1-TβR1相互作用
通过分子对接预测AMF与TβR1的结合位点，分子动力学模拟分析结合稳定性，SPR检测结合亲和力，co-IP检测AMF对TGF-β1-TβR1结合的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | 穗花杉双黄酮（AMF） | MedChemExpress | HY-N0662 |
| 卡托普利 | -- | -- | |
| 超声心动图 | Vevo2100高分辨率成像系统 | Visual Sonics | -- |
| 血清生化检测 | ALT检测试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | C009-3-1 |
| AST检测试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | C010-3-1 | |
| 甘油三酯检测试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | A110-1-1 | |
| 胆固醇检测试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | A111-1-1 | |
| ThermoScientific Multiskan GO分光光度计 | -- | -- | |
| 血糖检测 | 罗氏活力血糖仪 | Roche | -- |
| 组织学染色 | HE染色试剂盒 | Solarbio | G1120 |
| 天狼星红染色试剂盒 | Abcam | ab150681 | |
| 心肌细胞横截面积 | 小麦胚芽凝集素 | Thermo Fisher | W11261 |
| 免疫荧光 | DAPI | Beyotime | C1005 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 0.25%胰酶 | Solarbio | -- | |
| I型胶原酶 | Solarbio | -- | |
| 青霉素-链霉素-两性霉素B | Solarbio | -- | |
| 药物处理 | 血管紧张素II | Sigma | -- |
| 重组人TGF-β1 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞活性检测 | CCK-8试剂盒 | MCE | HY-K0301 |
| 酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| RNA提取与qRT-PCR | 总RNA提取试剂盒 | Solarbio | R1200 |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara | RR036A | |
| SYBR Green荧光染料 | Takara | CN830S | |
| 7300实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞增殖检测 | Click-iT EdU细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher | C10338 |
| 免疫荧光 | 抗cTNT抗体 | Invitrogen | MA5-12960 |
| 抗α-SMA抗体 | Invitrogen | 14-9760-82 | |
| 抗波形蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5741S | |
| 山羊抗小鼠IgG（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab150113 | |
| 山羊抗兔IgG（Alexa Fluor 594） | Abcam | ab150080 | |
| 抗荧光淬灭剂 | Beyotime | P0128S | |
| 蛋白质提取与Western blot | 强裂解液 | Solarbio | R0010 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Solarbio | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0011 | |
| Western blot | IRDye 800CW二抗 | LI-COR | -- |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596018 |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | -- | |
| RNA 6000 Nano LabChip试剂盒 | Agilent | 5067-1511 | |
| SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | 1896649 | |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| SPR | 重组人TGF-β RI蛋白 | SinoBiological | 10459-H02H |
| Biacore T200系统 | Cytiva | -- | |
| Series S CM5传感芯片 | Cytiva | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9.0 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系：C57BL/6J，8周龄，雌雄各半；TAC手术方法：26G针头缩窄主动脉弓；AMF剂量：25 mg/kg，腹腔注射，每日一次，术后持续6周；阳性对照：卡托普利20 mg/kg/day 阅读提示：Methods 2.1 |
| 超声心动图 | 使用Vevo2100系统，30 MHz探头，测量LVEF、LVFS和心室壁厚度 阅读提示：Methods 2.2 |
| 体外细胞实验 | NRVMs和NRCFs分离方法：1-3天SD大鼠；AMF工作浓度：25 μM；Ang II刺激浓度：20 μM，时间48小时；TGF-β1刺激条件（浓度未明确说明） 阅读提示：Methods 2.7, 2.8, 2.9, 2.10, 2.11, 2.12 |
| 分子靶点验证 | 分子对接：使用AutoDock Vina和AlphaFold3；SPR：使用Biacore T200，重组人TGF-β RI蛋白，AMF浓度12.5-200 μM；co-IP：心脏组织 阅读提示：Methods 2.14, 2.15, 2.16, 2.17 |