SP-D表达分析
评估SFTPD在多种癌症类型及肺癌不同阶段的表达水平。
通过TCGA、TNMplot和CRUK数据集的转录组分析，以及CPTAC蛋白组数据、单细胞数据和空间转录组数据，分析SFTPD表达；免疫组化检测人类肺癌组织中的SP-D蛋白。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
肺表面活性蛋白D通过下调IL-4/STAT6信号通路抑制肺癌进展
Pulmonary surfactant protein D reduces lung cancer progression associated with decreased IL-4/STAT6 signaling.
实验完整度
高实验包含体外细胞功能验证、异种移植小鼠模型、肺转移模型、患者样本分析及机制研究，涵盖多层级证据。
主要模型
A549肺腺癌细胞系 HCC827肺癌细胞系 H226肺鳞癌细胞系 NOG CIEA小鼠异种移植模型
重点核对
rhSP-D处理浓度（10 μg/ml）和时间（48小时） A549细胞皮下注射数量（1×10^6） 多西环素诱导浓度（2 mg/ml饮水） 鼻内给予rhSP-D剂量（15 μg/天）和持续时间（21天） 患者样本分组（SFTPD高/低表达，IL-4信号高/低）
摘要
肺表面活性蛋白D（SP-D）是一种与肺癌相关的先天免疫分子，其表达与改善的生存率和减少的肿瘤生长相关。尽管SP-D与肺部病理学相关，但SP-D调控的转录程序及其在癌症进展和转移中的作用仍知之甚少。通过对多模式人类数据的整合分析，我们证明SP-D基因（SFTPD）在转移性非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达降至接近缺失，将其缺失与转移进展联系起来。在A549肺腺癌细胞中过表达SFTPD显著降低了体内肿瘤生长和转移，而鼻内给予SP-D蛋白减少了肺肿瘤负荷。机制上，SP-D抑制了包括IL-4/STAT6信号在内的多种信号通路。对临床肺肿瘤样本的分析证实，SFTPD表达与IL-4/STAT6信号降低相关，且肿瘤中SFTPD低表达和IL-4信号升高的患者表现出最差的无病生存期。我们的发现表明，SP-D与NSCLC细胞相互作用，部分通过阻断IL-4/STAT6信号通路来抑制肺癌进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SP-D在肺癌进展和转移中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- SP-D直接结合IL-4受体（IL-4R），阻断IL-4/STAT6信号通路，从而抑制肺癌细胞增殖和转移。
- 主要证据
- 体外实验显示rhSP-D抑制A549、HCC827和H226细胞增殖、迁移和克隆形成；体内实验显示SFTPD过表达或鼻内rhSP-D减少肿瘤生长和转移；临床样本显示SFTPD表达与IL-4/STAT6信号负相关，且低SFTPD和高IL-4信号患者无病生存期最差。
- 研究意义
- 研究表明SP-D可作为肺癌治疗的潜在靶点，通过恢复或增加SP-D水平可能抑制肺癌进展，尤其是通过阻断IL-4/STAT6信号通路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能实验
验证rhSP-D对肺癌细胞增殖、迁移和克隆形成的影响。
使用A549、HCC827和H226细胞系，通过WST-1、EdU、克隆形成和Transwell迁移实验评估rhSP-D处理后的细胞功能。
体内异种移植实验
评估SFTPD过表达对A549肿瘤生长和转移的影响。
将doxycycline诱导的SFTPD过表达A549细胞皮下注射到NOG CIEA小鼠，7周后切除原发肿瘤，11周后分析肺部转移灶。
体内肺转移模型
评估鼻内给予rhSP-D对肺肿瘤生长的影响。
通过尾静脉注射A549细胞建立实验性肺转移模型，同时每天鼻内给予rhSP-D或PBS，21天后分析肺部肿瘤负荷和pSTAT6表达。
机制研究
阐明SP-D抑制IL-4/STAT6信号的分子机制。
通过RNA测序分析rhSP-D处理的A549细胞中信号通路变化；通过Western blot检测IL-4/IL-13刺激后的蛋白磷酸化；通过ELISA和表面等离子共振检测SP-D与IL-4R的结合。
临床样本分析
验证SP-D表达与IL-4/STAT6信号在患者肿瘤中的相关性及其对预后的影响。
利用TCGA和CRUK队列的RNA-seq数据，将样本按SFTPD表达分组，进行差异表达分析和通路富集分析；通过Kaplan-Meier曲线分析不同分组间的无病生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | ScienCell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | ScienCell | -- | |
| 重组蛋白表达 | pcDNA3.1 plus载体 | Genscript | -- |
| ExpiCHO-S细胞 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ExpiFectamine转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ExpiFectamine CHO增强子 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ExpiCHO补料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 重组蛋白纯化 | 杜氏磷酸盐缓冲液 | Gibco | -- |
| Q-Max PES针头式过滤器 | Frisenette | -- | |
| 内毒素检测 | Toxinsensor显色法鲎试剂内毒素检测试剂盒 | Genscript | -- |
| 增殖检测 | WST-1试剂 | Merck | -- |
| EdU检测 | Click-iT EdU细胞增殖成像试剂盒 | Thermo Fisher | C10337 |
| 迁移实验 | Transwell插入小室（8 μm孔径） | Corning | -- |
| Hemacolor染色液 | Merck | -- | |
| 奥林巴斯IX73显微镜 | Olympus | -- | |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | -- | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | Sigma | -- |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| Complete蛋白酶抑制剂混合物片剂 | Roche | -- | |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | Amersham | -- |
| Roti block封闭液 | -- | -- | |
| 抗pSTAT6抗体 | Cell Signaling Technology | 9361T | |
| 抗p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 9212S | |
| 抗磷酸化p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 9211S | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4685S | |
| 抗磷酸化Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4056S | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695T | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4376S | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-32233 | |
| 二抗 | Dako | -- | |
| 成像 | Chemidoc成像系统 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| ECL化学发光试剂 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Ambion | -- |
| RNA定量 | Qubit 3.0荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA质量控制 | Fragment Analyzer 5200片段分析仪 | Agilent | -- |
| RNA测序 | NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| ELISA结合实验 | 重组人IL-4受体 | Sino Biological | 10402-H08H |
| 生物素化抗SP-D抗体 | Bioporto | Hyb 246-04 | |
| 辣根过氧化物酶偶联链霉亲和素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 表面等离子共振 | Biacore T200仪器 | Cytiva | -- |
| C1型传感器芯片 | Cytiva | -- | |
| ELISA检测 | 96孔Maxisorp微孔板 | Nunc | -- |
| 载体构建 | pLVX-TetOne-puro载体 | -- | 1609305A |
| EcoRI限制性内切酶 | -- | -- | |
| BamHI限制性内切酶 | -- | -- | |
| In-Fusion HD克隆试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| pVSVG包装质粒 | Addgene | #138479 | |
| pRSV-Rev包装质粒 | Addgene | #12253 | |
| pMDL g/p RRE包装质粒 | Addgene | #12251 | |
| 转染 | 聚凝胺 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 筛选 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| RT-qPCR | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| TaqMan基因表达检测 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TaqMan通用PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| qTOWER3 PCR热循环仪 | Analytik-Jena | -- | |
| GAPDH内参基因 | Thermo Fisher Scientific | Mm99999915 | |
| SFTPD Taqman引物 | Thermo Fisher Scientific | Mm00486060 | |
| 动物实验 | 多西环素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 组织固定 | 中性缓冲福尔马林 | -- | -- |
| 免疫组化 | 抗Ki-67抗体 | Ventana Medical Systems (Roche) | 790-4286 |
| 抗SP-D抗体 | Bioporto | Hyb 245-1 | |
| Optiview-DAB显色试剂 | Roche | -- | |
| EnVision FLEX+小鼠检测系统 | DAKO | K800221-2 | |
| 切片扫描 | NanoZoomer-XR扫描仪 | Hamamatsu Photonics | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（ATCC）和培养条件（RPMI-1640, 10% FBS, 1% P/S） 阅读提示：Methods：Cell culture |
| 体外增殖实验 | rhSP-D浓度（10 μg/ml）和处理时间（48小时）；细胞密度（1×10^4） 阅读提示：Methods：Cell proliferation assay (WST-1) 和 EdU assay |
| 体外迁移实验 | Transwell孔径（8 μm），细胞密度（5×10^4），处理时间（24小时） 阅读提示：Methods：Cell migration assay |
| 体内异种移植实验 | 细胞数量（1×10^6），注射方式（皮下），小鼠品系（NOG CIEA），多西环素浓度（2 mg/ml饮水），肿瘤切除时间（7周），转移分析时间（11周） 阅读提示：Methods：Mice xenograft studies |
| 体内肺转移模型 | 细胞数量（1×10^6），注射途径（尾静脉），rhSP-D剂量（15 μg/天）和持续时间（21天） 阅读提示：Methods：Mice xenograft studies |
| RNA测序 | rhSP-D浓度（10 μg/ml），处理时间（48小时），生物学重复数（n=3） 阅读提示：Methods：RNA sequencing |
| Western blot | rhSP-D浓度（50 μg/ml）预处理2小时，IL-4/IL-13刺激浓度（10 ng/ml）和时间（15分钟） 阅读提示：Methods：Protein sample preparation and Western blotting |
| 结合实验 | ELISA中IL-4Rα包被浓度（1 μg/ml），SPR中IL-4R固定量（14 fmol/mm^2），SP-D浓度范围（1.5-200 nM） 阅读提示：Methods：Binding assay using ELISA 和 Surface plasmon resonance analysis |
| 患者数据分析 | 分组标准（SFTPD高/低为前/后10%），差异表达分析工具（DESeq2），生存分析分组（基于中位数） 阅读提示：Methods：STAT6 and IL-4 signaling pathway analysis in clinical samples 和 Survival analysis |