分析POSTN在结直肠癌中的表达与临床相关性
探究POSTN在结直肠癌中的表达水平及其与患者预后的关系。
利用TCGA和GEO数据集分析POSTN表达差异，结合临床生存数据，并通过IHC和单细胞测序验证其表达来源。
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成纤维细胞来源的POSTN通过重编程肿瘤细胞脂肪酸代谢促进高脂饮食下结直肠癌的进展
Fibroblast-derived POSTN promotes colorectal cancer progression under high-fat diet by reprogramming fatty acid metabolism in tumor cell.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内小鼠模型（AOM-DSS、移植瘤）、患者样本分析及机制验证，证据层级多且完整。
主要模型
HFD-AOM-DSS诱导的结直肠癌小鼠模型 MC38细胞皮下移植瘤模型 结直肠癌细胞系HCT116、HT29、MC38 肥胖相关结直肠癌患者组织样本
重点核对
POSTN基因敲除（POSTN-KO）小鼠的构建与基因型鉴定 HFD-AOM-DSS诱导结直肠癌模型中AOM剂量、DSS浓度及处理周期 移植瘤模型中MC38细胞接种数量（5×10^6）及HFD喂养周期（12周） 体外实验中FFA处理浓度（1 mM）及POSTN重组蛋白浓度（100 ng/mL） 抑制剂LY294002、PD98059和Cilengitide的给药剂量
摘要
POSTN的异常表达与癌症的发展密切相关，尤其是在结直肠癌中。然而，POSTN在高脂饮食下对结直肠癌进展的影响及机制尚未被深入研究。在体外和体内评估了POSTN对HFD诱导的结直肠癌的影响，并分析了不同脂质代谢酶表达的动态变化。分子和生物学实验揭示了POSTN调节脂肪积累和脂肪酸氧化失调产生的潜在机制。POSTN在结直肠癌患者中表达显著升高，并与临床预后不良相关，主要来源于myCAF。成纤维细胞来源的POSTN缺失抑制了HFD下结直肠癌的进展。机制上，成纤维细胞来源的POSTN通过调节AKT信号通路促进肿瘤细胞中SREBP1的表达，从而促进脂肪酸合成。同时，成纤维细胞来源的POSTN通过ERK信号通路抑制肿瘤细胞中FAO相关酶CPT1A的活性，从而抑制FAO过程。此外，我们发现CD51抑制剂Cilengitide能有效抑制结直肠癌细胞的异常增殖，从而抑制HFD环境下的肿瘤发展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 成纤维细胞来源的POSTN在高脂饮食条件下如何影响结直肠癌的发生与发展？
- 核心机制
- 成纤维细胞来源的POSTN通过激活AKT信号通路上调SREBP1促进脂肪酸合成，并通过ERK信号通路抑制CPT1A进而抑制脂肪酸氧化。
- 主要证据
- 通过TCGA和GEO数据分析、临床样本IHC、scRNA-seq、AOM-DSS模型、移植瘤模型、体外共培养、Western blot、BODIPY染色及TG/NEFA检测，验证了POSTN在HFD下对脂质代谢的调控作用。
- 研究意义
- 研究揭示POSTN是肥胖相关结直肠癌的潜在治疗靶点和预后生物标志物，为开发靶向治疗策略提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估POSTN缺失对HFD下结直肠癌发生发展的影响
验证POSTN敲除是否抑制HFD诱导的结直肠癌进展。
构建POSTN敲除小鼠，通过HFD-AOM-DSS模型和皮下移植瘤模型观察肿瘤发生和发展情况。
体外验证成纤维细胞来源POSTN对肿瘤细胞脂质代谢的影响
明确POSTN在体外对肿瘤细胞脂质积累和脂肪酸代谢的调控作用。
分离WT和POSTN-KO小鼠成纤维细胞，与MC38细胞共培养或使用条件培养基处理肿瘤细胞，检测TG、NEFA及脂滴积累。
探究POSTN调控脂肪酸合成的分子机制
确定POSTN是否通过AKT/SREBP1轴促进脂肪酸合成。
使用Western blot检测AKT磷酸化水平，使用AKT抑制剂LY294002处理细胞，检测SREBP1表达及脂质含量变化。
探究POSTN调控脂肪酸氧化的分子机制
确定POSTN是否通过ERK/CPT1A轴抑制脂肪酸氧化。
使用Western blot检测ERK磷酸化水平，使用ERK抑制剂PD98059处理细胞，检测CPT1A表达及脂质含量变化。
评估Cilengitide靶向治疗对HFD下结直肠癌的疗效
验证Cilengitide能否通过阻断POSTN信号通路抑制肿瘤生长。
体外用Cilengitide处理细胞，体内建立移植瘤模型并给予Cilengitide或联合AKT/ERK抑制剂，观察肿瘤生长和蛋白表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965092 |
| DMEM-F12培养基 | Gibco | A4192001 | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | A4192301 | |
| 胎牛血清 | Gibco | A5256701 | |
| 药物处理 | 游离脂肪酸 | -- | -- |
| 油酸 | Macklin | O815202-500mL | |
| 棕榈酸 | Macklin | P799157-100 g | |
| 细胞培养 | 牛血清白蛋白 | Beyotime | ST023-50 g |
| 转染 | Lipo6000转染试剂 | Beyotime | C0526-1.5 ml |
| 药物处理 | 重组POSTN蛋白 | Sinobiological | 10299-H08H |
| LY294002 | Macklin | L832989-10 mg | |
| PD98059 | Macklin | P832941-5 mg | |
| 西仑吉肽 | Bidepharm | BD628662 | |
| 染色 | 油红O | Servicebio | G1015-100ML |
| BODIPY 493/503探针 | Beyotime | C2053S | |
| JC-10荧光探针 | Yeasen | 40707ES03 | |
| DAPI染色液 | Beyotime | C1002 | |
| Western blot | SREBP1抗体 | Affinity | AF6283 |
| CPT1A抗体 | Beyotime | AF6558 | |
| ERK抗体 | Servicebio | GB11560 | |
| p-ERK抗体 | Servicebio | GB11004 | |
| AKT抗体 | Beyotime | AF1777 | |
| p-AKT抗体 | Beyotime | AF1546 | |
| α-SMA抗体 | Affinity | AF1032 | |
| I型胶原抗体 | Proteintech | 14695-AP | |
| POSTN抗体 | Proteintech | 66491-1-Ig | |
| STAT3抗体 | Proteintech | 60199-1-Ig | |
| p-STAT3 (Ser727)抗体 | Proteintech | 60479-1-Ig | |
| β-actin抗体 | Servicebio | ZB15001-HRP-100 | |
| HRP标记二抗 | Biosharp | BL003A | |
| IHC | DAB显色试剂盒 | ZSBG-BIO | ZLI-9018 |
| 脂质检测 | 甘油三酯检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 |
| 游离脂肪酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A042-1-1 | |
| ELISA | 胰岛素ELISA试剂盒 | Shanghai Fenxi Biology | FXs39290 |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Shanghai Fenxi Biology | FXs07158 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Shanghai Fenxi Biology | FXs08784 | |
| 细胞活力检测 | MTT试剂 | Beyotime | C0009S |
| 动物实验 | 氧化偶氮甲烷 | Macklin | A885948-100 mg |
| 葡聚糖硫酸钠 | Macklin | D806297-250 g | |
| 抑制剂处理 | NSC74859 | Ambeed | A111782 |
| 免疫荧光 | 高清快速三维成像系统 | -- | -- |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | AOM剂量（12.5 mg/kg）、DSS浓度（2% w/v）、HFD喂养周期（28天预处理，全程HFD） 阅读提示：Methods - Induction of CRC 与图2A 图注 |
| 细胞培养与处理 | 细胞系（HT29、HCT116、MC38）的来源与培养条件、FFA浓度（1 mM）及处理时间（24 h） 阅读提示：Methods - Cell lines and cell cultures 与图2图注 |
| 体外功能验证 | 共培养比例（5×10^5 MC38 + 5×10^4 NFs）、条件培养基收集（5×10^5细胞/100mm皿，培养48h）、POSTN重组蛋白浓度（100 ng/mL） 阅读提示：Methods - Conditioned Medium collection 与图4图注 |
| 信号通路验证 | 抑制剂浓度（LY294002 20 µM、PD98059 10 µM、Cilengitide 10 µM）及处理时间（24 h） 阅读提示：Methods - Oil Red O staining 与图5、6、7图注 |
| 移植瘤模型 | MC38细胞接种数量（5×10^6）、HFD喂养时间（12周）、给药剂量（LY294002 10 mg/kg，PD98059 10 mg/kg，Cilengitide 20 mg/kg） 阅读提示：Methods - Tumor transplanted in vivo 与图2E、图3C、图7D图注 |