生产腺病毒载体疫苗
准备用于小鼠免疫的Ad5-S和Ad5-EGFP疫苗。
将编码SARS-CoV-2刺突蛋白或EGFP的基因克隆到pAdApt质粒，转染HEK293A细胞产生腺病毒，经扩增和CsCl梯度离心纯化，透析后分装保存。
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SARS-CoV-2疫苗接种后小鼠体液免疫反应评估方案
Protocol for evaluating humoral immune responses in mice following SARS-CoV-2 vaccination.
实验完整度
中包含明确的实验步骤：疫苗生产、小鼠免疫、ELISA和假病毒中和试验，但缺少动物实验的详细重复数和具体统计方法。
主要模型
BALB/c小鼠（6-8周龄雌性） HEK293A细胞 HEK293T细胞 HEK293T-ACE2细胞
重点核对
疫苗剂量：1×10^8 vp/只 小鼠品系和年龄：雌性BALB/c小鼠，6-8周龄 免疫途径：双侧大腿肌肉注射 ELISA起始稀释度：1:100，3倍系列稀释 中和试验起始稀释度：1:20，3倍系列稀释
摘要
结合抗体和中和抗体是抵抗病毒病原体的关键指标，对于评估疫苗的免疫原性和效力至关重要。在此，我们提出一个包含两种检测方法的方案，用于测量严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）疫苗接种后小鼠血浆中刺突蛋白特异性结合抗体和中和抗体。我们描述了使用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定结合抗体滴度，以及通过假病毒中和试验评估中和抗体滴度的步骤。有关此方案的完整使用和执行细节，请参考Jingyou Yu等人1。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估SARS-CoV-2疫苗在小鼠中诱导的体液免疫反应，包括结合抗体和中和抗体的滴度。
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- 使用ELISA和假病毒中和试验检测了Ad5-S疫苗免疫的小鼠血浆中的S特异性结合抗体和中和抗体，结果显示Ad5-S组显著高于Ad5-EGFP对照组。
- 研究意义
- 为评估SARS-CoV-2疫苗免疫原性提供了一套标准的检测方案。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠免疫
诱导小鼠产生针对SARS-CoV-2刺突蛋白的体液免疫反应。
对6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行双侧大腿肌肉注射1×10^8 vp的腺病毒载体疫苗（Ad5-S或Ad5-EGFP）。
ELISA检测结合抗体
测定免疫小鼠血浆中S蛋白特异性结合抗体滴度。
用RBD蛋白包被ELISA板，加入不同稀释度的血浆，孵育后加入HRP标记的二抗，TMB显色，测定450 nm吸光度。
假病毒生产和滴度测定
制备用于中和试验的SARS-CoV-2刺突假病毒。
将psPAX2、pLenti-CMV Puro-Luc和pcDNA3.1-S.dCT13质粒共转染HEK293T细胞，48小时后收集上清，过滤后感染HEK293T-ACE2细胞，通过荧光素酶活性测定病毒滴度。
假病毒中和试验
测定免疫小鼠血浆中的中和抗体滴度。
将不同稀释度的血浆与假病毒共孵育，然后感染HEK293T-ACE2细胞，检测荧光素酶活性，计算NT50。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | Cat# C11995500BT |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | Cat# FSP500 | |
| Opti-MEM I低血清培养基 | Gibco | Cat# 31985070 | |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | Cat# 23966 |
| 腺病毒生产 | PacI限制性内切酶 | NEB | Cat# R0547 |
| 腺病毒纯化 | 脱氧胆酸钠 | Sigma | Cat# D6750 |
| 1 M 氯化镁 | LEAGENE | Cat# R00482 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | Cat# 104159 | |
| 氯化铯 | Macklin | Cat# C804679 | |
| 1 M Tris盐酸缓冲液 pH 7.5 | Yuanye | Cat# R21385 | |
| 甘油 | Macklin | Cat# G810575 | |
| 咪唑 | Solarbio | 288-32-4 | |
| 蛋白酶抑制 | 蛋白酶抑制剂混合物 | MCE | Cat# HY-K0010 |
| 蛋白浓缩 | Amicon Ultra超滤管 | MCE | Cat# UFC9030 |
| 蛋白纯化 | 高亲和力Ni-NTA树脂 | GenScript | Cat# L00250 |
| ELISA | 山羊抗小鼠IgG-HRP | Sino Biological | Cat# SSA007 |
| TMB底物 | Solarbio | Cat# PR1200 | |
| ELISA包被缓冲液 | Solarbio | Cat# C1050 | |
| Difco脱脂牛奶 | BD Life Sciences | Cat# 90002-594 | |
| 吐温20 | Diamond | Cat# A100777-0500 | |
| ELISA终止液 | Solarbio | Cat# C1058 | |
| 假病毒中和试验 | 萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Beyotime | Cat# RG006 |
| 细胞培养 | 0.05%胰蛋白酶-EDTA | Gibco | Cat# 25300062 |
| 磷酸盐缓冲液 | Biosharp | Cat# BL302A |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠免疫 | 小鼠品系和年龄：雌性BALB/c小鼠，6-8周龄；疫苗剂量：1×10^8 vp/只；注射途径：双侧大腿肌肉注射 阅读提示：Preparation 2: Mice immunization, Step 10和Table 1 |
| ELISA | 包被蛋白浓度：1 μg/mL；血浆稀释起始：1:100，3倍系列稀释；二抗浓度：0.25 μg/mL 阅读提示：ELISA process, Step 14-18和Table 2 |
| 假病毒生产 | 质粒比例：psPAX2: pLenti-CMV Puro-Luc: pcDNA3.1-S.dCT13 = 10:10:5 μg；转染细胞：HEK293T；转染试剂：PEI 阅读提示：Lenti-pseudovirus production, Step 20-25 |
| 假病毒中和试验 | 血浆稀释起始：1:20，3倍系列稀释；细胞：HEK293T-ACE2；孵育时间：36-48小时 阅读提示：Lentiviral luciferase-based pseudovirus neutralization assay, Step 26-32和Table 3 |