MAPIT-seq方法开发和优化
验证MAPIT-seq的可行性并确定最佳实验条件
在HeLa和HEK293T细胞中，通过控制甲醛浓度、pAG-脱氨酶构型和浓度、二抗使用等因素，检测编辑信号并评估转录组保留程度。
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原位 RNA-蛋白质相互作用与转录组在单细胞和组织中的联合分析
Co-profiling of in situ RNA-protein interactions and transcriptome in single cells and tissues.
实验完整度
高包含体外细胞系、小鼠胚胎组织、单细胞测序及长读长测序等多层级实验，并通过多种方法交叉验证RBP靶标和功能实验。
主要模型
HeLa细胞 HEK293T细胞 小鼠胚胎脑组织 10x单细胞HeLa细胞
重点核对
使用0.5%甲醛固定细胞，在RT固定5分钟 使用1:100稀释的一抗和二抗，pAG-脱氨酶浓度18-36 μg/ml 在300 mM NaCl的高盐洗涤条件下进行去氨化反应 使用10x Genomics平台进行单细胞分析 以G3BP1敲低HeLa细胞作为功能验证模型
摘要
RNA结合蛋白（RBPs）是RNA命运和功能的关键调控因子。研究RBP调控的一个长期挑战是在动态转录组背景下绘制RNA相互作用组，尤其是在单细胞和原代组织环境中。本文介绍了MAPIT-seq（修饰添加至RBP相互作用转录本测序），它利用抗体引导的编辑策略同时绘制全基因组原位RBP–RNA相互作用和基因表达图谱。我们展示了MAPIT-seq在多个RBP中的稳健性，并系统分析了与核心多梳抑制复合物2（PRC2）组分相关的RNA底物。MAPIT-seq也适用于冷冻组织切片，能够绘制大脑发育过程中RBP的作用。重要的是，我们开发了高通量单细胞MAPIT-seq（scMAPIT-seq）以揭示细胞阶段特异性的RBP调控。总之，MAPIT-seq扩展了多组学分析，为研究动态生物学过程和临床相关场景中的转录后调控提供了有效框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何开发一种能同时在单细胞和组织中原位检测RNA结合蛋白相互作用与基因表达的方法？
- 核心机制
- MAPIT-seq利用抗体引导的ADAR2和APOBEC1双重脱氨酶编辑RBP结合的RNA，形成特异性编辑信号，从而识别RBP靶标。
- 主要证据
- 通过多RBP验证、与PAR-CLIP等已有方法比较、PRC2组分只有XIST被共同检测、scMAPIT-seq显示G3BP1靶标的细胞周期特异性调控等结果并得到功能验证。
- 研究意义
- MAPIT-seq作为双组学平台，可应用于冷冻组织切片和单细胞，研究动态过程和临床相关场景中的转录后调控。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MAPIT-seq验证
评估MAPIT-seq与已有RBP-RNA相互作用检测方法的一致性
比较MAPIT-seq与PAR-CLIP、eCLIP、iCLIP、CLAP-seq等得出的RBP靶标，并分析编辑信号的富集和特异性。
识别RBP结合基序
确定MAPIT-seq能否检测已知的RBP序列偏好
通过FLARE鉴定高置信编辑簇，并用HOMER进行基序分析，比较已知基序的富集情况。
PRC2-RNA相互作用评估
重新评估PRC2组分与RNA的原位结合
对EED、EZH2、SUZ12和CHTOP进行MAPIT-seq，分析编辑信号和靶标鉴定。
组织切片中的G3BP1研究
检验MAPIT-seq在组织切片中的适用性并研究G3BP1在脑发育中的作用
对E10.5、E12.5和E16.5小鼠胚胎或脑组织切片进行MAPIT-seq，鉴定G3BP1靶标并进行功能富集分析。
单细胞MAPIT-seq开发
实现单细胞分辨率的RBP相互作用和转录组联合分析
首先尝试FRISCR和10x平台，优化固定条件（使用DSP），然后对HeLa细胞进行高通量scMAPIT-seq分析。
长读长MAPIT-seq
解析转录本亚型特异性的RBP结合
使用PacBio平台进行长读长测序，分析G3BP1在不同转录本亚型上的编辑信号。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | SH30243.01 |
| 胎牛血清 | GeminiBio | 900-108 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140163 | |
| 细胞转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus-transfection | PT-114-75 |
| 潮霉素B | Roche | 10843555001 | |
| 蛋白表达与纯化 | Strep-Tactin磁珠 | Smart Lifesciences | SA053 |
| 蛋白纯化 | Superdex 200 Increase 层析柱 | GE Healthcare | -- |
| Western blot | 抗G3BP1抗体 | Proteintech | 13057-2-AP |
| 抗GAPDH抗体 | Huabio | ET1601-4 | |
| 驴抗兔IgG二抗 | LI-COR | 926-32213 | |
| MAPIT-seq | 抗FLAG抗体 | Sigma | F1804 |
| 小鼠IgG | Santa Cruz Biotech | sc-2025 | |
| 兔IgG | CST | 2729S | |
| 抗G3BP1抗体 | Abcam | ab56574 | |
| 抗PTBP1抗体 | Millipore | MABE986 | |
| 抗YTHDF2抗体 | Proteintech | 24744-1-AP | |
| 抗SERBP1抗体 | BETHYL | A303-938A | |
| 抗RBFOX2抗体 | BETHYL | A300-864A | |
| 抗PUM1抗体 | Abcam | ab92545 | |
| 抗EED抗体 | CST | 85322 | |
| 抗EZH2抗体 | CST | 5246 | |
| 抗SUZ12抗体 | CST | 3737 | |
| 抗CHTOP抗体 | Invitrogen | PA544307 | |
| 兔抗小鼠二抗 | Abcam | ab46450 | |
| 豚鼠抗兔二抗 | Antibodies Online | ABIN101961 | |
| ConA磁珠 | Bangs Laboratories | BP531 | |
| RNA酶抑制剂 | ThermoFisher | EO0382 | |
| 蛋白酶K | Invitrogen | AM2546 | |
| Oligo d(T)25磁珠 | NEB | S1419S | |
| RNA-seq文库构建 | VAHTS Universal V6 RNA-seq文库制备试剂盒 | Vazyme | NR604 |
| 组织切片 | OCT包埋剂 | Sakura | 4583 |
| 多聚赖氨酸包被的玻璃载玻片 | Citotest | 188105W | |
| RIP-qPCR | 蛋白G磁珠 | Invitrogen | -- |
| HiScript III Q逆转录预混液 | Vazyme | R323 | |
| SYBR Green预混液 | Vazyme | Q141 | |
| ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 长读长测序 | Kinnex全长RNA试剂盒 | Pacbio | 103-072-000 |
| Pacbio Revio测序仪 | Pacbio | -- | |
| 单细胞测序 | 10x Genomics Chromium平台 | 10x Genomics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与固定 | 细胞系（HeLa、HEK293T）、培养条件、甲醛浓度0.5%固定5分钟、甘氨酸终止 阅读提示：Methods 'Cell culture' 和 'MAPIT-seq' 部分 |
| 抗体孵育 | 一抗和二抗的稀释比例（1:100）、孵育时间和温度（4°C） 阅读提示：Methods 'Antibodies' 和 'MAPIT-seq' 部分 |
| 脱氨反应 | pAG-脱氨酶浓度、孵育时间，脱氨缓冲液成分和温度（30°C, 3小时） 阅读提示：Methods 'MAPIT-seq' 部分 |
| 组织切片特异性 | 组织类型（小鼠E10.5、E12.5、E16.5胚胎），切片处理（新鲜冷冻），固定浓度（0.2%甲醛） 阅读提示：Methods 'Mice and preparation of tissue slides' 和 'MAPIT-seq' 部分 |
| 单细胞MAPIT-seq | 固定方法（DSP）、单细胞平台（10x Genomics）、细胞数量、QC标准 阅读提示：Methods 'MAPIT-seq' 部分和补充方法 |