构建携带MLL3缺失的乳腺肿瘤模型
模拟人类乳腺癌中的MLL3突变并与PIK3CA和TP53突变协同，研究其对肿瘤发生的作用。
从携带条件性Pik3ca突变（Pik3caH1047R或Pik3ca*）的小鼠乳腺组织中分离MaSC，用Cre腺病毒激活突变，并用CRISPR依次敲除Trp53和Mll3基因，获得P5（Pik3ca突变/p53缺失）和MP5（额外Mll3缺失）MaSC类器官。
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MLL3突变通过HIF1α依赖的瘤内调节性T细胞招募和分化促进乳腺癌进展
Mutations in MLL3 promote breast cancer progression via HIF1α-dependent intratumoral recruitment and differentiation of regulatory T cells.
实验完整度
高包含体外细胞模型（MaSC类器官）、体内移植模型、Treg细胞耗竭实验、混合骨髓嵌合体、抗体治疗以及患者样本验证，并进行了机制研究（HIF1α稳定性、CCL2调控）和多层次功能验证。
主要模型
小鼠乳腺干细胞（MaSC）类器官 同种异体移植小鼠模型 人类乳腺癌患者样本
重点核对
MLL3缺失与PIK3CA和TP53突变在小鼠MaSC中的组合（P5与MP5模型） HIF1α稳定化及其对CCL2表达的调控 CCR2介导的Treg细胞招募 BLIMP-1依赖的Treg细胞分化 ICOS/GITR靶向治疗对Treg细胞和肿瘤生长的影响
摘要
MLL3（编码组蛋白甲基转移酶MLL3/KMT2C）的功能缺失突变在多种癌症类型中频繁发生。为了研究MLL3抑制肿瘤发生的机制，我们开发了一种基于小鼠乳腺干细胞的肿瘤模型，该模型携带癌症驱动突变，包括MLL3/KMT2C和p53缺失以及组成性PI3激酶激活，重现了侵袭性人类乳腺癌的遗传组成。MLL3缺失稳定了转录因子HIF1α，后者增加了肿瘤细胞趋化因子CCL2的分泌，并促进了CCR2+调节性T（Treg）细胞的招募。Treg细胞耗竭减缓了肿瘤的发生和进展。在人类乳腺肿瘤中，Treg细胞的浸润与MLL3突变的存在相关。HIF1α强制BLIMP-1依赖的肿瘤浸润性Treg细胞分化为表达ICOS和GITR的效应细胞，这些细胞分泌免疫抑制细胞因子TGFβ和IL-10。靶向ICOS或GITR的抗体耗竭了肿瘤Treg细胞并抑制了肿瘤发生。因此，MLL3突变在侵袭性乳腺癌以及其他可能的功能性MLL3缺失的癌症中塑造了免疫抑制的肿瘤免疫微环境。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MLL3功能缺失如何与PIK3CA和TP53突变协同促进乳腺癌进展，其机制是否涉及免疫微环境重塑？
- 核心机制
- MLL3缺失降低HIF1α赖氨酸甲基化，稳定HIF1α，HIF1α直接转录上调CCL2，通过CCR2招募Treg细胞，并促进BLIMP-1依赖的Treg细胞分化为高免疫抑制性效应细胞，分泌TGFβ和IL-10，从而建立免疫抑制微环境，加速肿瘤发生和生长。
- 主要证据
- 小鼠MaSC模型（P5 vs MP5）显示MP5肿瘤生长更快；流式细胞术和免疫荧光证实MP5肿瘤中Treg细胞增多；HIF1α缺失或CCL2中和或Treg耗竭延缓肿瘤发生；患者样本中MLL3突变与Treg浸润正相关；ICOS/GITR抗体治疗抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 研究揭示了MLL3突变通过HIF1α/CCL2/CCR2轴和Treg细胞分化促进免疫抑制微环境的机制，为MLL3突变及HIF1α高表达乳腺癌提供了潜在的免疫治疗策略（抗ICOS/GITR）。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证MLL3缺失对肿瘤发生和生长的影响
评估MLL3缺失是否加速肿瘤发生和生长。
将P5和MP5 MaSC异位移植到同背景野生型小鼠的乳腺脂肪垫中，监测肿瘤发生率和肿瘤体积。
免疫细胞浸润分析
鉴定MLL3缺失引起的肿瘤免疫微环境变化，特别是Treg细胞。
对早期肿瘤结节（1-2mm）进行高维光谱流式细胞术分析，使用27种标记物，并通过t-SNE进行降维聚类，比较P5和MP5肿瘤中免疫细胞亚群。
Treg细胞功能及表型分析
评估MP5肿瘤中Treg细胞的免疫抑制功能是否增强。
从Foxp3RFP报告小鼠中分选P5和MP5肿瘤中的Treg细胞，进行体外抑制试验，并检测TGFβ和IL-10的表达。
HIF1α机制研究
探究MLL3缺失如何稳定HIF1α并促进Treg细胞浸润。
检测HIF1α蛋白稳定性（放线菌酮处理）和赖氨酸甲基化水平；通过ChIP-qPCR验证HIF1α结合Ccl2基因调控区域；在MP5细胞中敲低Hif1a，评估对肿瘤生长和Treg细胞浸润的影响。
CCL2/CCR2轴验证
验证肿瘤细胞来源的CCL2对Treg细胞招募的必需性。
用抗CCL2中和抗体处理MP5肿瘤小鼠；在P5细胞中过表达CCL2；使用CCR2敲除混合骨髓嵌合体比较WT和Ccr2−/− Treg细胞的肿瘤浸润。
BLIMP-1依赖的Treg分化
验证HIF1α促进Treg细胞分化为免疫抑制效应细胞是否依赖BLIMP-1。
生成Foxp3CreBlimp-1WT和Foxp3CreBlimp-1LoxP/LoxP混合骨髓嵌合体小鼠，移植MP5 MaSC，分析WT和BLIMP-1−/− Treg细胞在肿瘤中的表型。
ICOS/GITR靶向治疗
评估抗ICOS或抗GITR抗体对肿瘤发生和生长的治疗效果。
在MP5 MaSC移植小鼠中，预防性给予抗ICOS、抗GITR或同型对照抗体，监测肿瘤发生；在已建立的肿瘤（~50mm3）中给予相同治疗，并与抗PD-1比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Advanced DMEM/F-12培养基 | Life Technologies | -- |
| 基质胶 | Corning | 354234 | |
| Y-27632 | Cayman Chemical | 10005583 | |
| 表皮生长因子 | Sigma | E9644 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | EMD Millipore | GF003 | |
| 肝素 | Sigma | H3149 | |
| III型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004182 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Worthington Biochemical | LS002139 | |
| 分散酶 | Worthington Biochemical | LS02109 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | -- | -- | |
| 病毒转导 | 聚凝胺 | EMD-Millipore | TR-1003-G |
| Lenti-X浓缩试剂 | Clontech | 631232 | |
| 基因编辑 | lentiCRISPRv2-puro载体 | Addgene | 98290 |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP载体 | Addgene | 57823 | |
| lentiCRISPRv2-GFP载体 | Addgene | 82416 | |
| 过表达 | pLV-EF1α-IRES-Blast载体 | Addgene | 85133 |
| qPCR | PowerUp SYBR Green预混液 | ThermoFisher | A25742 |
| 高容量cDNA逆转录试剂盒 | ThermoFisher | 4368814 | |
| Quick-RNA微量制备试剂盒 | Zymo Research | R1050 | |
| ELISA | 小鼠MCP-1 ELISA试剂盒 | Thermo Scientific | 88-7391-22 |
| TGFβ ELISA试剂盒 | BioLegend | 436707 | |
| IL-10 ELISA试剂盒 | BioLegend | 431411 | |
| 蛋白定量 | DC蛋白测定 | BIO-RAD | 5000111 |
| ChIP | Dynabeads M-280羊抗小鼠IgG磁珠 | Invitrogen | 11201D |
| ChIP DNA清洁浓缩试剂盒 | Zymo Research | D5205 | |
| 流式细胞术 | CellTrace紫荧光染料 | ThermoFisher | C34571 |
| Fc阻断剂（2.4G2） | -- | -- | |
| eBioscience固定/破膜缓冲液 | eBioscience | -- | |
| Cytek Aurora流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| FACSAria III流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞因子检测 | 细胞因子26重检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 动物实验 | 白喉毒素 | Calbiochem | 322326 |
| 抗体治疗 | 抗小鼠MCP-1/CCL2抗体（克隆2H5） | BioXCell | -- |
| 仓鼠IgG2a同型对照 | BioXCell | -- | |
| 抗小鼠ICOS抗体（克隆7E.17G9） | BioXCell | -- | |
| 抗GITR抗体（克隆DTA-1） | BioXCell | -- | |
| 抗PD-1抗体（克隆29F.1A12） | BioXCell | -- | |
| 大鼠IgG2b同型对照 | BioXCell | -- | |
| 免疫组化 | 抗HIF1α抗体 | -- | NB-100-105 |
| 免疫荧光 | 抗FOXP3抗体 | -- | 见表S1 |
| 抗Ki67抗体 | -- | 见表S1 | |
| 组织学 | 3DHistec Pannoramic 250 Flash II玻片扫描仪 | 3DHistec | -- |
| AXIO Examiner D1显微镜 | Zeiss | -- | |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMOG | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MaSC分离与培养 | 小鼠品系、胶原酶浓度、消化时间、培养基组成、基质胶浓度、生长因子浓度 阅读提示：STAR Methods: Isolating MaSCs and culturing MaSC organoid |
| 基因编辑 | sgRNA序列、载体、选择抗生素浓度 阅读提示：STAR Methods: CRISPR-based genome editing |
| 肿瘤移植模型 | 细胞数量、注射部位、小鼠品系和性别、肿瘤发生标准 阅读提示：STAR Methods: Tumor onset and growth |
| Treg细胞耗竭 | DT剂量和给药频率、Foxp3DTR小鼠品系 阅读提示：STAR Methods: In vivo Treg cell or macrophage depletion |
| 抗体治疗 | 抗体克隆、剂量、给药途径和频率 阅读提示：STAR Methods: In vivo Treg cell or macrophage depletion |
| 流式细胞术 | 抗体克隆和荧光标记、破膜缓冲液、仪器型号 阅读提示：STAR Methods: Cell-staining for FACS analysis, Table S1 |
| ChIP-qPCR | 低氧条件、交联方法、抗体、染色质用量 阅读提示：STAR Methods: ChIP-qPCR |