抗M1R/B6R抗体的表征及双特异性设计以增强正痘病毒保护

Anti-M1R/B6R antibody characterization and bispecific design for enhanced orthopoxvirus protection.

作者信息Runchu Zhao, Lili Wu, Yi Zhang, Jianrong Ma, Dezhi Liu, Yuxuan Zheng, Tianxiang Kong, Renyi Ma, Zhengrong Gao, Yan Chai, Yuanlang Liu, Yi Tian, Yunxiang Xia, Yongzhi Hou, Jiahan Lu, Zhe Cong, Baoying Huang, Wenjie Tan, Jing Xue, George F Gao, Qihui Wang

PMID40921877

期刊EMBO Mol Med

发布时间2025-10

DOI10.1038/s44321-025-00299-z

来源查看原文

实验完整度

高

研究包含抗体生成、体外功能验证（ELISA、SPR、PRNT）、体内保护实验（小鼠模型）和结构解析（晶体结构），多个独立证据层级共同支持结论。

主要模型

BALB/c小鼠模型（VACV感染） CB-17 SCID小鼠模型（MPXV感染） CAST/EiJ小鼠模型（MPXV感染）

重点核对

抗体给药方案：10 mg/kg或5 mg/kg，腹腔注射，攻毒前4小时和后4小时（BALB/c）或攻毒前24小时（CAST/EiJ）病毒攻毒剂量和途径：VACV-WR鼻内攻毒（BALB/c）；MPXV WIBP-MPXV-001 腹腔和鼻内攻毒（CB-17 SCID）；MPXV CAMS-CCPM-B-V-052-2306-1 腹腔攻毒（CAST/EiJ）中和试验：VACV-IMV PRNT（两倍稀释）和VACV-EEV PRNT（三倍稀释，含补体）病毒载量检测：组织样本（肺、脾、卵巢等）通过qPCR定量，检测时间点（5 dpi或9 dpi等）双特异性抗体格式：IgG-scFv和VH-CH1转换区插入格式

摘要

猴痘病毒（MPXV）引起的人类猴痘全球暴发，凸显了对安全有效疗法的迫切需求。在本研究中，我们通过对免疫小鼠的单克隆抗体（MAbs）进行测序，并通过体外和体内结合及抗病毒活性评估分析其表位和功能，表征了MPXV主要免疫原M1R和B6R。我们鉴定了几种广泛有效的抗M1R和抗B6R中和MAbs，在抗体鸡尾酒和双特异性抗体设计中，它们对MPXV或痘苗病毒（VACV）表现出增强的抗病毒效果。值得注意的是，VH-CH1转换区插入形式的双特异性抗体在小鼠模型中对VACV表现出强大的保护功效。总之，我们的研究表征了抗M1R和抗B6R MAbs的表位和功能图谱，并开发了治疗MPXV和其他正痘病毒感染的广谱抗体候选药物。

抗M1R和B6R单克隆抗体的生成

获得针对MPXV关键免疫原M1R和B6R的单克隆抗体。

用编码MPXV抗原的mRNA疫苗免疫BALB/c小鼠，两次免疫后进行VACV攻毒，60天后从存活的淋巴结中分离抗原特异性B细胞，进行单细胞V(D)J测序，并重组表达抗体。

抗体的结合特性分析

确定抗体的表位分类和结合亲和力。

通过ELISA和BLI进行表位竞争分析，通过SPR测量结合亲和力，使用B6R片段和M1R肽段进行表位定位。

抗体的中和活性测定

评估抗M1R和抗B6R抗体对VACV的中和能力。

通过PRNT检测抗M1R抗体对VACV-IMV和抗B6R抗体对VACV-EEV的中和活性；EEV中和实验在补体存在下进行。

抗体的体内保护实验

评估抗M1R和抗B6R抗体在动物模型中对VACV和MPXV的保护效果。

在BALB/c小鼠中，攻毒VACV-WR前后给予抗体，监测体重、生存率和肺病毒载量；在CB-17 SCID和CAST/EiJ小鼠中，使用MPXV攻毒，评估不同组织的病毒载量。

结构解析

阐明抗体与M1R结合的分子基础。

通过坐滴气相扩散法结晶，收集X射线衍射数据，使用Phaser分子置换、Coot模型构建和PHENIX精修，解析hmMM1-40和mMM1-16与M1R的复合物结构。

抗体鸡尾酒和双特异性抗体的评估

评估组合策略（鸡尾酒和双特异性抗体）的抗病毒效果。

将hmMM1-40和hMB621组合为鸡尾酒或设计成IgG-scFv和VH-CH1转换区插入格式的双特异性抗体，在VACV或MPXV攻毒模型中评估保护效果。

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养	DMEM培养基	Gibco	C11995500BT
胎牛血清	GIBCO	10270106
SMM 293-TII培养基	Sino Biological	M293TII
蛋白质纯化	HisTrap HP 5 mL预装柱	Cytia	17524802
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg凝胶过滤柱	Cytia	28989335
抗体纯化	Protein A HP 5 mL预装柱	Cytia	17040303
SPR分析	Series S传感器芯片Protein A	Cytia	29127556
细胞培养	聚乙烯亚胺	Alfa	A04043896-1g
受体竞争实验	7D11抗体	--	--
检测	TaqMan基因表达预混液	ThermoFisher	4369016

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养

DMEM培养基

Gibco

C11995500BT

胎牛血清

GIBCO

10270106

SMM 293-TII培养基

Sino Biological

M293TII

蛋白质纯化

HisTrap HP 5 mL预装柱

Cytia

17524802

HiLoad 16/600 Superdex 200 pg凝胶过滤柱

Cytia

28989335

抗体纯化

Protein A HP 5 mL预装柱

Cytia

17040303

SPR分析

Series S传感器芯片Protein A

Cytia

29127556

细胞培养

聚乙烯亚胺

Alfa

A04043896-1g

受体竞争实验

7D11抗体

检测

TaqMan基因表达预混液

ThermoFisher

4369016

环节	核对要点
抗体生成	免疫剂量和次数：mRNA疫苗编码MPXV抗原，两次免疫，免疫间隔时间？攻毒时间：第二次免疫后两周。抗体序列克隆：pCAGGS载体。阅读提示：Methods：Isolation of antigen-specific B cells and recombinant monoclonal antibodies production
结合分析	ELISA抗原包被浓度：2 μg/mL；抗体检测浓度：10 μg/mL；BLI竞比时第一和第二抗体浓度：50 μg/mL；SPR捕获抗体浓度：0.5 μg/mL。阅读提示：Methods：Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), BLI assay, SPR analysis
中和试验	IMV中和：病毒量约150 PFU，抗体系列二倍稀释，孵育1 h，Vero细胞感染，40 h培养；EEV中和：病毒量约100 PFU，抗体系列三倍稀释，补体（10%幼兔补体），7D11浓度50 μg/mL，孵育2 h。阅读提示：Methods：Plaque reduction neutralization test (PRNT)
体内保护实验（VACV）	小鼠品系、性别、年龄：6-8周龄雌性BALB/c；抗体剂量：10 mg/kg（图3）或5 mg/kg（图6和EV4）；给药途径：腹腔注射；攻毒途径：鼻内接种VACV-WR；给药时间：攻毒前4h和后4h（图3,6），或攻毒前24h/-24h和攻毒后24h/+24h（图EV4）；监测时间：5天或9天。阅读提示：Methods：Animal protection experiments（VACV protection in BALB/c mice）；Figure legends 3A, 6B, EV4A,D
体内保护实验（MPXV）	小鼠品系：CB-17 SCID（6-8周龄雌性）和CAST/EiJ（4-10周龄，性别比例）；攻毒剂量：WIBP-MPXV-001 (0.2×107 PFU intranasally and 4.8×107 PFU intraperitoneally)，CAMS-CCPM-B-V-052-2306-1 1×106 PFU腹腔；抗体剂量：5 mg/kg（CB-17）或10 mg/kg（CAST/EiJ）；给药时间：攻毒前4h和后4h（CB-17），攻毒前24h（CAST）；监测时长：10天或4天；病毒载量检测组织：肺、脾、卵巢（CB-17），血浆、脾、肺、肝、肾、脑、卵巢/睾丸（CAST）。阅读提示：Methods：Animal protection experiments（MPXV protection in CB-17 SCID mice, MPXV protection in CAST/Eij mice）；Figure legends 5A,D, EV3A
结构解析	蛋白浓度：8 mg/mL；结晶条件：hmMM1-40复合物（1% w/v tryptone, 0.05 M HEPES sodium pH 7.0, 20% w/v PEG3350），mMM1-16复合物（0.2 M ammonium fluoride, 20% w/v PEG3350）；衍射数据收集波长：0.979183 Å；分辨率：2.80 Å和2.70 Å。阅读提示：Methods：Crystallization and structure determination

环节

核对要点

抗体生成

免疫剂量和次数：mRNA疫苗编码MPXV抗原，两次免疫，免疫间隔时间？攻毒时间：第二次免疫后两周。抗体序列克隆：pCAGGS载体。

阅读提示：Methods：Isolation of antigen-specific B cells and recombinant monoclonal antibodies production

结合分析

ELISA抗原包被浓度：2 μg/mL；抗体检测浓度：10 μg/mL；BLI竞比时第一和第二抗体浓度：50 μg/mL；SPR捕获抗体浓度：0.5 μg/mL。

阅读提示：Methods：Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), BLI assay, SPR analysis

中和试验

IMV中和：病毒量约150 PFU，抗体系列二倍稀释，孵育1 h，Vero细胞感染，40 h培养；EEV中和：病毒量约100 PFU，抗体系列三倍稀释，补体（10%幼兔补体），7D11浓度50 μg/mL，孵育2 h。

阅读提示：Methods：Plaque reduction neutralization test (PRNT)

体内保护实验（VACV）

小鼠品系、性别、年龄：6-8周龄雌性BALB/c；抗体剂量：10 mg/kg（图3）或5 mg/kg（图6和EV4）；给药途径：腹腔注射；攻毒途径：鼻内接种VACV-WR；给药时间：攻毒前4h和后4h（图3,6），或攻毒前24h/-24h和攻毒后24h/+24h（图EV4）；监测时间：5天或9天。

阅读提示：Methods：Animal protection experiments（VACV protection in BALB/c mice）；Figure legends 3A, 6B, EV4A,D

体内保护实验（MPXV）

小鼠品系：CB-17 SCID（6-8周龄雌性）和CAST/EiJ（4-10周龄，性别比例）；攻毒剂量：WIBP-MPXV-001 (0.2×107 PFU intranasally and 4.8×107 PFU intraperitoneally)，CAMS-CCPM-B-V-052-2306-1 1×106 PFU腹腔；抗体剂量：5 mg/kg（CB-17）或10 mg/kg（CAST/EiJ）；给药时间：攻毒前4h和后4h（CB-17），攻毒前24h（CAST）；监测时长：10天或4天；病毒载量检测组织：肺、脾、卵巢（CB-17），血浆、脾、肺、肝、肾、脑、卵巢/睾丸（CAST）。

阅读提示：Methods：Animal protection experiments（MPXV protection in CB-17 SCID mice, MPXV protection in CAST/Eij mice）；Figure legends 5A,D, EV3A

结构解析

蛋白浓度：8 mg/mL；结晶条件：hmMM1-40复合物（1% w/v tryptone, 0.05 M HEPES sodium pH 7.0, 20% w/v PEG3350），mMM1-16复合物（0.2 M ammonium fluoride, 20% w/v PEG3350）；衍射数据收集波长：0.979183 Å；分辨率：2.80 Å和2.70 Å。

阅读提示：Methods：Crystallization and structure determination

大家都在搜

大家都在搜