蛋白表达与纯化
获得用于结构、相互作用和酶活研究的活性PP2A:B55全酶、底物和调节因子蛋白
在大肠杆菌中表达p107、Eya3、Eya2、CDK2-cyclin A2等蛋白；在Expi293F细胞中共表达B55和PP2Ac，纯化PP2A:B55复合物；纯化PP2Aa并加入B55/PP2Ac形成全酶。
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PP2A:B55与p107和Eya3的冷冻电镜结构定义底物募集机制
Cryo-EM structures of PP2A:B55 with p107 and Eya3 define substrate recruitment.
实验完整度
高包含独立证据层级：冷冻电镜结构解析、NMR相互作用和去磷酸化实验，以及功能验证（IC50测定、pulldown实验）。
主要模型
PP2A:B55全酶（人源，全长B55、PP2Ac和PP2Aa重组表达） p107底物（人源，p107612-687等片段） Eya3调节因子（人源，Eya362-108EE等片段） 体外NMR和酶活测定体系
重点核对
p107和Eya3的B55结合片段（p107612-687、Eya362-108EE）及PP2A:B55复合物制备 冷冻电镜数据采集与处理参数（如像素尺寸、粒子数、分辨率） CDK2-cyclin A2磷酸化p107的条件（25μM p107、500:1酶底物比、500μM ATP、37°C 1小时） NMR去磷酸化实验条件（PP2A:B55与p107比例1:500，时间点监测） IC50测定条件（DiFMUP底物、PP2A:B55浓度1nM、p107和Eya3浓度梯度）
摘要
磷酸蛋白磷酸酶（PPPs）通过使用PPP特异性短基序结合底物和调节因子来实现特异性。蛋白磷酸酶2A（PP2A）是一种高度保守的磷酸酶，调控细胞信号传导，并且是一种肿瘤抑制因子。在这里，我们使用冷冻电镜和核磁共振（NMR）波谱研究人类p107底物和Eya3调节因子募集到PP2A:B55全酶上的机制。我们表明，尽管它们使用一组共同的相互作用口袋与B55结合，但底物和调节因子的结合机制不同，并且与PP2A:B56和其他PPPs所观察到的机制不同。我们还鉴定了Eya3蛋白中核心的B55募集基序，该序列在Eya家族中是保守的。最后，利用基于NMR的去磷酸化实验，我们证明了B55募集如何通过特定磷酸位点的选择性去磷酸化来引导PP2A:B55的保真度。由于PP2A:B55协调有丝分裂和DNA损伤修复，这些数据为通过单独阻断使用不同B55相互作用位点的一小部分调节因子来寻求治疗性靶向该复合物的新途径提供了路线图。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PP2A:B55如何特异性招募底物p107和调节因子Eya3，以及这种招募如何引导特定磷酸位点的去磷酸化？
- 核心机制
- p107和Eya3通过不同的构象（螺旋和延伸构象）结合B55的相同口袋，p107的S640位点靠近活性位点而被优先去磷酸化，而S615位点由于远离活性位点而难以去磷酸化。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构（2.6和2.7Å）显示p107形成螺旋，Eya3延伸结合；NMR去磷酸化实验显示pS640快速去磷酸化，pS615缓慢。
- 研究意义
- 研究为理解PP2A:B55在细胞周期和DNA损伤修复中的作用提供分子基础，并为通过靶向不同B55相互作用位点来治疗性干预该复合物提供路线图。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NMR相互作用分析
鉴定p107和Eya3中与B55和PP2A:B55结合的残基，并监测结合引起的强度和化学位移变化
用15N标记p107或Eya3，与B55LL或PP2A:B55孵育，采集2D [1H,15N] HSQC谱，比较峰强度变化。
冷冻电镜结构解析
解析PP2A:B55与p107和Eya3复合物的高分辨率结构
制备PP2A:B55–p107和PP2A:B55–Eya3复合物，进行冷冻电镜数据采集、处理、三维重构和模型构建。
体外酶活抑制测定
评估p107和Eya3对PP2A:B55催化活性的影响
使用DiFMUP作为底物，测量不同浓度p107或Eya3存在下的IC50。
p107磷酸化和去磷酸化实验
确定PP2A:B55对p107特定磷酸位点的去磷酸化偏好
先用CDK2-cyclin A2磷酸化p107，再用PP2A:B55处理，通过NMR监测磷酸化和去磷酸化过程。
Eya2和Eya3H79R结合的验证
验证Eya2和Eya3H79R是否直接结合PP2A:B55
通过pulldown实验，将纯化的Eya2或Eya3H79R与表达GFP-B55的Expi293F细胞裂解液孵育，用GFP trap珠子免疫沉淀，免疫印迹检测结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
激酶和磷酸酶活性分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质表达 | 大肠杆菌BL21(DE3)细胞 | Agilent | -- |
| Expi293F细胞 | Thermo Fisher Scientific | A14527 | |
| 聚乙烯亚胺（PEI） | Polysciences | -- | |
| 细胞培养 | SMM293-TII培养基 | Sino Biological | M293TII |
| 蛋白质纯化 | HisTrap HP柱 | Cytiva | -- |
| Superdex 75 16/60 | Cytiva | -- | |
| Superdex 200 26/60 | Cytiva | -- | |
| HiTrap Q HP柱 | Cytiva | -- | |
| GFP trap琼脂糖珠 | -- | -- | |
| 冷冻电镜 | Titan Krios G3i | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Titan Krios G4 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| K3相机 | Gatan | -- | |
| Falcon 4i直接探测器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Vitrobot MK IV | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| UltAuFoil 1.2/1.3 300目载网 | SPT Labtech | -- | |
| NMR | Bruker Avance Neo 600或800 MHz NMR波谱仪 | Bruker | -- |
| 酶活测定 | 二氟甲基伞形酮磷酸酯 | -- | -- |
| CLARIOstarPlus酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| 蛋白质磷酸化 | 三磷酸腺苷（ATP） | Sigma | -- |
| 蛋白质纯化 | Avestin Emulsiflex C3高压细胞破碎仪 | Avestin | -- |
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF质粒大提试剂盒 | Macherey-Nagel | -- | |
| 免疫印迹 | 抗B55抗体 | Cell Signaling Technology | 2290 |
| 抗PP2Ac抗体 | Millipore | MABE1783 | |
| 抗PP2Aa抗体 | Biolegend | 824901 | |
| 抗Strep抗体 | Genscript | A01732 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | 表达宿主（大肠杆菌BL21、Expi293F细胞），诱导条件（OD600~0.8，1mM IPTG，18°C过夜），纯化缓冲液和色谱柱类型 阅读提示：Methods: Bacterial protein expression, Mammalian protein expression, p107, Eya3 and Eya2 purification |
| NMR相互作用实验 | 蛋白质浓度（2-6μM），结合蛋白浓度（过剩≥25%），缓冲液组成（p107 NMR buffer: 10mM Na3PO4 pH6.3, 150mM NaCl, 0.5mM TCEP；Eya3 buffer: 10mM Na3PO4 pH6.5, 200mM NaCl, 0.5mM TCEP），温度283K 阅读提示：Methods: NMR interaction studies of p107 and EYA3 with PP2A:B55 and B55LL |
| 冷冻电镜结构 | 复合物浓度（2.4mg/ml），摩尔比（1.5:1和1.56:1），CHAPSO浓度（0.125%和0.1%），网格类型，电镜参数（电压300kV，像素尺寸0.827/0.73Å，剂量39.6/51.04 e/Ų），最终粒子数（195,950/107,919） 阅读提示：Methods: Cryo-EM sample preparation, Cryo-EM data acquisition and processing, Table 1 |
| 体外酶活测定 | 反应缓冲液（30mM HEPES pH7.0, 150mM NaCl, 1mM MnCl2, 1mM DTT, 0.01% Triton X-100, 0.1mg/ml BSA），酶浓度（1nM），底物浓度（DiFMUP 50μM），反应时间（30min），温度（30°C），终止液（300mM磷酸钾pH10） 阅读提示：Methods: DiFMUP fluorescence intensity assay for PP2A:B55 IC50 measurements |
| p107磷酸化与去磷酸化实验 | 磷酸化条件：p107浓度25μM，CDK2-cyclin A2比例1:500，ATP浓度500μM，37°C 1小时；去磷酸化条件：PP2A:B55与p107比例1:500，NMR监测每28分钟 阅读提示：Methods: p107 phosphorylation, NMR dephosphorylation |
| pulldown实验 | 细胞裂解液表达GFP-B55、3xFLAG-PP2Ac和6xHis-PP2Aa，纯化蛋白（p107/Eya2/Eya3），GFP trap beads捕获，洗涤缓冲液（20mM Tris pH8.0, 500mM NaCl, 0.5mM TCEP, 1mM MnCl2），洗脱（2% SDS，90°C 10min） 阅读提示：Methods: p107, Eya3 and Eya2 interaction with the PP2A:B55 complex |