鉴定RSMC为Sororin相互作用蛋白
寻找SMC3乙酰化之外调节Sororin招募的未知因子。
通过免疫沉淀偶联质谱（IP-MS）鉴定与Flag-Sororin相互作用的蛋白，发现alt-ORF C11ORF98编码的微蛋白RSMC。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
微蛋白RSMC的S期PAR化增强Sororin在姐妹染色单体黏连中的功能
S-phase PARylation of microprotein RSMC enhances the function of Sororin in sister chromatid cohesion.
实验完整度
高包括体外pull-down、免疫共沉淀、PLA、ChIP、染色质分级、染色体铺展、免疫荧光、MST及体内外PARylation等，涵盖生化、细胞和分子多个层级，并包含功能验证及机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 HeLa细胞 HEK293T RSMC+/−细胞 HeLa RSMC-3Flag细胞
重点核对
RSMC敲低效率约60%，通过qRT-PCR和免疫印迹验证 siRNA靶向RSMC不影响LBHD1 mRNA水平 PARP抑制剂olaparib处理浓度10 μM，处理48小时 双胸苷阻断同步化，释放后S期5小时检测 RSMC-16A和RSMCΔSIM为相互作用缺陷突变体
摘要
Sororin对于在后生动物中与DNA复制同时建立姐妹染色单体黏连至关重要。尽管cohesin亚基SMC3被ESCO1/2乙酰化是Sororin招募所必需的，但仅此并不足够。在此，我们证明DNA复制偶联的聚(ADP-核糖)聚合酶（PARP）活性是人类细胞中的一个额外先决条件。在正常S期，PARP1使由替代开放阅读框C11ORF98编码的微蛋白（我们命名为RSMC，即28S rRNA/核糖体和Sororin微辅助因子）发生PAR化。这种PAR化增强了RSMC与Sororin的相互作用，与SMC3乙酰化协同增强Sororin的染色质招募和抗Wapl活性。值得注意的是，RSMC的过表达能够挽救由PARP抑制剂olaparib诱导的黏连缺陷。这些发现突显了未被充分研究的微蛋白作为基本细胞过程（如姐妹染色单体黏连）的关键调节因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SMC3乙酰化不足以完全招募Sororin，哪些额外因子参与DNA复制偶联的姐妹染色单体黏连建立？
- 核心机制
- 在S期，PARP1使微蛋白RSMC发生PAR化，增强RSMC与Sororin的相互作用，与ESCO1/2介导的SMC3乙酰化协同，促进Sororin招募到cohesin并增强其抗Wapl活性。
- 主要证据
- IP-MS鉴定RSMC为Sororin相互作用蛋白；RSMC敲低导致黏连缺陷；PLA和pull-down证实相互作用；体外PARylation实验证明PARP1修饰RSMC；MST实验显示RSMC增强Sororin的抗Wapl活性。
- 研究意义
- 揭示微蛋白RSMC作为基本细胞过程（如姐妹染色单体黏连）的关键调节因子，并阐明PARP活性在该过程中的新作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证RSMC与Sororin的相互作用
确认RSMC与Sororin的物理结合及其在细胞内的邻近性。
通过免疫共沉淀（CoIP）和原位邻近连接分析（PLA）验证RSMC与Sororin及cohesin亚基SMC3的相互作用。
评估RSMC在姐妹染色单体黏连中的功能
确定RSMC是否参与姐妹染色单体黏连的建立。
通过siRNA敲低RSMC，使用染色体铺展和Giemsa染色分析黏连缺陷，并使用CRISPR/dCas9-GFP标记测量姐妹染色单体间距离。
绘制RSMC-Sororin相互作用界面
确定RSMC中负责与Sororin结合的结构域，并验证其对黏连功能的重要性。
通过AlphaFold2和GRAMM预测结构，构建RSMC截短和点突变体，进行体外pull-down和功能性回补实验。
检测RSMC对Sororin染色质招募的影响
确定RSMC是否影响S期Sororin向染色质/cohesin的招募。
通过染色质分级、免疫共沉淀检测Sororin-SMC3相互作用、ChIP检测RSMC在CARs的结合，以及免疫荧光分析染色质结合的Sororin。
研究PARP1对RSMC的PAR化修饰及功能
探究PARP1是否PAR化RSMC，并调节RSMC-Sororin相互作用及Sororin招募。
通过CoIP、PLA检测PARP1-RSMC相互作用，体外PARylation实验，体内PARylation实验，以及olaparib处理抑制PARP活性，评估对Sororin染色质招募和黏连的影响。
验证RSMC增强Sororin的抗Wapl活性
确定RSMC是否通过增强Sororin的抗Wapl活性来促进黏连。
通过Wapl敲低回补RSMC缺陷细胞的黏连表型，并利用竞争性微量热泳动（MST）测量Wapl-PDS5B结合的Kd。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11995500BT |
| 胎牛血清 | ABW | AB-FBS0500 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| 聚乙烯亚胺 | Yeasen | 40816ES02 | |
| 药物处理 | 奥拉帕利 | Selleck | S1060 |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| 免疫印迹 | Immobilon-P PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| PLA | Duolink PLA试剂盒 | Sigma-Aldrich | DUO92101 |
| 体外PAR化 | 重组人PARP-1蛋白 | Sino Biological | 11040-H08B |
| 体内PAR化 | 没食子单宁 | Sigma-Aldrich | V900190 |
| MST | Monolith NT.115标准处理毛细管 | NanoTemper | MO-K002 |
| 质谱 | Q Exactive混合四极杆-Orbitrap质谱仪 | Thermo Fisher | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与同步化 | 细胞系来源；双胸苷阻断条件（2 mM胸苷，16小时释放8小时，再16小时）。 阅读提示：Methods：Cell lines and cell culture；Cell synchronization |
| RNA干扰 | siRNA序列及浓度；转染试剂（Lipofectamine 3000）及转染时间。 阅读提示：Methods：Plasmid construction, transfection, RNA interference |
| 染色体铺展 | 诺考达唑浓度（100 ng/mL）和处理时间（4小时）；低渗处理（75 mM KCl，5分钟）；固定液Carnoy's solution；吉姆萨染色浓度。 阅读提示：Methods：Chromosome spreads |
| 染色质分级 | CSK缓冲液成分；裂解时间（20分钟）；离心条件（2000×g，5分钟）；药物处理时间（olaparib 10 μM，1小时；emetine 2 μM，1小时）。 阅读提示：Methods：Chromatin fractionation |
| PLA | 细胞预处理（0.1% Triton X-100，5分钟）；固定（4% PFA，15分钟）；抗体稀释度（anti-Sororin 1:100，anti-PARP1 1:200，anti-Flag 1:200）；olaparib处理时间（释放前1小时）。 阅读提示：Methods：Proximity ligation assay |
| MST | PDS5B浓度（34 nM），Wapl浓度梯度（116-3.54 nM），Sororin和RSMC浓度（17 nM）；缓冲液成分（50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 0.05% Tween-20）；测量温度（25°C）。 阅读提示：Methods：Competitive microscale thermophoresis |