全激酶组siRNA筛选
鉴定TLR7/8介导的促炎细胞因子产生中的关键激酶
在THP-1细胞中使用激酶组siRNA文库进行筛选，敲低后刺激R848，通过AlphaLISA检测TNF-α，并使用SSMD评分识别阳性靶点。
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TLR诱导的STK25激活促进IRF5介导的炎症
TLR-induced STK25 activation promotes IRF5-mediated inflammation.
实验完整度
高包含体外激酶实验、细胞报告基因实验、基因敲除小鼠原代细胞验证以及患者样本分析，覆盖功能与机制验证。
主要模型
THP-1单核细胞 人原代单核细胞及单核细胞来源树突状细胞 HEK293T细胞 Stk25基因敲除小鼠原代免疫细胞
重点核对
STK25通过磷酸化IRF5 Thr265位点促进IRF5转录激活 TLR7/8激动剂R848或TLR9激动剂CpG-B刺激诱导STK25 Thr174自身磷酸化 Stk25缺陷小鼠外周血CD11b+单核细胞和B220+ B细胞中IRF5核转位减少 Stk25缺陷小鼠脾细胞中R848和CpG-B诱导的IL-6产生减少 SLE患者PBMCs中STK25 Thr174自身磷酸化水平升高
摘要
转录因子干扰素调节因子5（IRF5）在MyD88依赖性TLR下游的炎症反应中起重要介导作用。尽管IRF5活性失调已被认为与多种自身免疫性疾病（包括系统性红斑狼疮）的发生有关，但调节TLR诱导的IRF5翻译后修饰的因素尚不清楚。本研究的重点是鉴定TLR-MyD88-IRF5信号传导中的新型激酶。我们在人THP-1单核细胞中进行全激酶组siRNA筛选，并确定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶25（STK25）通过磷酸化IRF5 Thr265位点促进促炎细胞因子产生，导致IRF5转录激活。我们进一步发现STK25在多种TLR刺激下发生自身磷酸化。在Stk25缺陷的原代免疫细胞中进行的验证显示，R848诱导的IRF5核转位和促炎细胞因子产生显著减弱。最后，我们发现系统性红斑狼疮供体免疫细胞中STK25自身磷酸化水平较健康对照升高。这些发现表明STK25通过调节IRF5激活成为TLR7/8信号传导的新调节因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在鉴定TLR-MyD88-IRF5信号通路中调节IRF5活性的新型激酶。
- 核心机制
- STK25通过直接磷酸化IRF5 Thr265位点促进IRF5的转录激活，从而增强促炎细胞因子产生。
- 主要证据
- 体外激酶实验显示STK25直接磷酸化IRF5 Thr265；在HEK293T细胞中，STK25共表达增强IRF5报告基因活性，而IRF5-T265A突变体则抑制；Stk25缺陷小鼠原代细胞中R848和CpG-B诱导的IRF5核转位及细胞因子产生减弱。
- 研究意义
- 本研究首次报道STK25通过调控Thr265介导IRF5转录激活，提示STK25可能成为治疗IRF5介导的免疫性疾病（如SLE）的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选激酶在人体原代细胞中的验证
验证候选激酶对TLR7/8诱导细胞因子产生的作用
从健康供体分离单核细胞，并分化为单核细胞来源树突状细胞，进行siRNA敲低后刺激R848，检测TNF-α和IL-6产生。
STK25对IRF5的直接磷酸化作用
确定候选激酶是否直接磷酸化IRF5
在体外使用放射性标记ATP进行闪烁亲近测定，检测候选激酶对IRF5 C端片段（残基222-467）的磷酸化。随后对全长IRF5进行体外激酶测定，并通过Phos-tag免疫印迹、质谱分析确定磷酸化位点。
STK25介导IRF5 Thr265磷酸化的功能验证
验证Thr265磷酸化对IRF5转录活性的功能影响
在HEK293T细胞中共表达IRF5和STK25，检测ISRE-荧光素酶报告基因活性；构建IRF5-T265A突变体；并通过CRISPR-Cas9生成STK25敲除细胞，观察内源STK25的作用。
TLR刺激下STK25的激活与表达
研究TLR刺激对STK25自身磷酸化和表达的影响
在THP-1细胞和Ramos B细胞中，使用R848、LPS或CpG-B刺激不同时间，通过免疫印迹检测STK25 Thr174磷酸化和总蛋白表达。
Stk25基因敲除小鼠原代细胞验证
在生理水平验证STK25对TLR诱导IRF5功能的影响
使用Stk25+/+和Stk25−/−小鼠，分离外周血细胞和脾细胞，刺激R848或CpG-B，检测IRF5核转位、细胞因子产生。
SLE患者PBMCs中STK25激活状态检测
评估SLE患者免疫细胞中STK25的自身磷酸化水平
收集健康对照和SLE患者的PBMCs，通过免疫印迹检测p-STK25（Thr174）和总STK25表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| siRNA筛选 | AlphaLISA免疫检测试剂盒 | PerkinElmer | AL208C |
| CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7570 | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| DMEM（高糖，GlutaMAX） | -- | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine 3000 RNAiMax转染试剂 | Invitrogen | 13778030 |
| 细胞培养 | Opti-MEM | Gibco | 31985062 |
| 免疫印迹 | NP-40裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | J60766-AP |
| Halt蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 87786 | |
| PhosStop磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | 4906845001 | |
| DC蛋白检测试剂盒 | Bio-Rad | 5000112 | |
| Bolt Bis-Tris系统 | Invitrogen | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | MDI | SCNX8402XXXX101 | |
| 丽春红S | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Tris缓冲盐水-0.05%吐温20 | Thermo Fisher Scientific | J77500.K2 | |
| 化学发光检测试剂 | Cytiva | RPN2232 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| Image Lab软件 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| β-actin HRP偶联抗体 | Cell Signaling | 12620 | |
| GAPDH HRP偶联抗体 | Cell Signaling | 3683 | |
| IRF5抗体 | Abcam | ab181553 | |
| 磷酸化苏氨酸抗体 | Cell Signaling | 9386 | |
| STK25抗体 | Abcam | ab157188 | |
| STK25 + MST4 + MST3（磷酸化T174 + T178 + T190）抗体 | Abcam | ab76579 | |
| IgG HRP偶联二抗 | Cell Signaling | 7074 | |
| 体外激酶实验 | 重组人IRF5蛋白 | Abcam | ab173024 |
| 重组人STK25蛋白 | Signalchem | S43-10G-10 | |
| 重组人IKKβ蛋白 | Signalchem | I03-10BG-10 | |
| 激酶活性检测 | ADP-Glo激酶检测试剂盒 | Promega | TM313 |
| 蛋白表达 | TnT快速偶联转录/翻译系统 | Promega | L1171 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| 报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E2920 |
| 质谱分析 | InstantBlue考马斯蛋白染色液 | Abcam | ab119211 |
| ProteaseMAX表面活性剂 | -- | -- | |
| Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Mascot | -- | -- | |
| 流式细胞术 | BD LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FlowJo软件 | BD Biosciences | -- | |
| CD45-APC/Cy7抗体 | BioLegend | 103116 | |
| CD11b-PE抗体 | BioLegend | 101208 | |
| B220-BV510抗体 | BioLegend | 103248 | |
| Ly6G-PerCP/Cy5.5抗体 | BioLegend | 127615 | |
| Ly6C-PE/Cy7抗体 | BioLegend | 128018 | |
| CD4-BV421抗体 | BioLegend | 100438 | |
| IL-6-APC抗体 | BioLegend | 504508 | |
| TNF-α-FITC抗体 | BioLegend | 506304 | |
| 成像流式细胞术 | Amnis ImageStream | -- | -- |
| Fc Shield（抗小鼠CD16/CD32） | Tonbo Biosciences | 70-0161-U500 | |
| IRF5抗体 | Abcam | 181553 | |
| 抗兔IgG二抗-APC | Invitrogen | A-10931 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Cytek Amnis ImageStream Mk II成像流式细胞仪 | Cytek Biosciences | -- | |
| IDEAS图像分析软件 | Cytek Biosciences | -- | |
| B220-FITC抗体 | BD Pharmingen | 553088 | |
| CD4-BV510抗体 | BioLegend | 100559 | |
| CD8a-APC/Cy7抗体 | BioLegend | 100714 | |
| CD11c-PE/Cy7抗体 | BioLegend | 117318 | |
| ELISA | 小鼠IL-6 Mini ABTS ELISA检测试剂盒 | PeproTech | 900-M50 |
| 细胞培养 | autoMACS Pan单核细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-537 |
| Dulbecco磷酸盐缓冲盐水 | -- | -- | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| ACCUSPIN管 | Sigma-Aldrich | A2055 | |
| MACS分离器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| IL-4 | -- | -- | |
| GM-CSF | -- | -- | |
| CRISPR-Cas9 | Alt-R S.p. Cas9核酸酶 | IDT | -- |
| Alt-R Cas9电穿孔增强剂 | IDT | -- | |
| P3核转染溶液 | Lonza | V4XP-3024 | |
| 核转染仪 | Lonza | -- | |
| 质粒构建 | Q5定点突变试剂盒 | NEB | -- |
| pcDNA3.1+/C-(K)-DYK载体 | GenScript | -- | |
| pcDNA3.1+载体 | GenScript | -- | |
| pGL3-ISRE-Luc载体 | Promega | -- | |
| pRL-CMV载体 | Promega | -- | |
| 激酶反应 | γ-33P ATP | -- | -- |
| 链霉亲和素偶联闪烁珠 | -- | -- | |
| 多重序列比对 | ClustalOWS | -- | -- |
| Jalview | -- | -- | |
| 数据可视化 | GraphPad Prism 9 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| siRNA筛选 | siRNA文库来源、转染条件、R848浓度、AlphaLISA试剂盒 阅读提示：见Materials and Methods 'Kinome-wide siRNA screen' |
| 人原代细胞验证 | 单核细胞分离方法、MDDC分化条件、siRNA转染浓度、R848刺激时间 阅读提示：见Materials and Methods 'Human primary monocyte isolation', 'Generation of human primary MDDCs', 'Human primary cell transfection' |
| 体外激酶实验 | 重组蛋白来源、浓度、反应缓冲液、孵育时间 阅读提示：见Materials and Methods 'In vitro kinase assay' |
| 报告基因实验 | 细胞密度、质粒用量、转染试剂、检测时间 阅读提示：见Materials and Methods 'Reporter assay' |
| STK25激活与表达 | 刺激物及浓度、时间点、抗体 阅读提示：见Results 'STK25 responds to TLR7/8 activation...' 和 Materials and Methods 'Immunoblot analysis' |
| 小鼠原代细胞验证 | 小鼠基因型、细胞分离、刺激浓度和时间、检测方法 阅读提示：见Materials and Methods 'Animals', 'Flow cytometry', 'Imaging flow cytometry', 'ELISA' |
| SLE患者PBMC检测 | 样本来源、抗体、归一化方法 阅读提示：见Results 'Basal autophosphorylation of STK25...' 和 Figure legend 5 |