全基因组CRISPR敲除筛选
鉴定SARS-CoV-2的宿主限制因子
使用Brunello CRISPR敲除文库转导A549-ACE2细胞，以SARS-CoV-2 trVLP-GFP感染，通过FACS分选GFP阳性细胞，提取基因组DNA进行sgRNA测序和MAGeCK分析。
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DAZAP2是一种泛冠状病毒限制因子，通过抑制病毒进入和基因组复制发挥作用。
DAZAP2 functions as a pan-coronavirus restriction factor by inhibiting viral entry and genomic replication.
实验完整度
高包含体外细胞感染模型、假病毒和复制子系统、小鼠模型、人原代气道上皮细胞培养等多层级验证，并明确进行了功能机制研究。
主要模型
A549-ACE2细胞 HeLa-ACE2细胞 MEF-ACE2细胞 Calu-3细胞 Dazap2基因敲除小鼠 人原代鼻和支气管上皮细胞(ALI培养模型)
重点核对
CRISPR筛选使用SARS-CoV-2 trVLP-GFP，MOI 0.5，感染24小时 验证实验使用两组独立sgRNA进行基因编辑 假病毒实验使用MLV假病毒，30 μL，感染24小时 内体进入实验使用E-64d（100 μM）和camostat mesylate（100 μM） 小鼠实验使用10-12周龄雌性小鼠，不同剂量（1,000或50 FFU）鼻内接种
摘要
SARS-CoV-2大流行和新变种的出现强调了理解宿主-病毒相互作用和识别限制病毒感染的宿主因子的必要性。在这里，我们进行了一项全基因组CRISPR敲除筛选，以识别SARS-CoV-2的宿主限制因子，揭示了DAZAP2是一种有效的抗病毒基因。DAZAP2，之前被认为与SARS-CoV-2限制有关，被发现通过阻断病毒粒子与内溶酶体和质膜的融合来抑制病毒进入。此外，DAZAP2抑制基因组RNA复制，但不影响病毒复制酶的初始翻译。我们证明DAZAP2在四个冠状病毒属中作为泛冠状病毒限制因子发挥作用。重要的是，敲除DAZAP2可增强小鼠模型和人原代气道上皮细胞中的SARS-CoV-2感染，证实了其生理相关性。在机制上，DAZAP2的抗病毒活性似乎是间接的，可能通过调节宿主基因表达实现，因为它主要定位于细胞核。我们的发现为宿主针对冠状病毒的防御系统提供了新的见解，并强调DAZAP2是宿主导向抗病毒治疗的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DAZAP2如何抑制SARS-CoV-2感染，其机制和生理相关性是什么？
- 核心机制
- DAZAP2通过阻断病毒粒子与内溶酶体和质膜的融合来抑制病毒进入，并抑制基因组RNA复制，但不影响初始翻译。其抗病毒活可能是间接的，通过调节宿主基因表达实现。
- 主要证据
- 证据来自CRISPR筛选和验证、假病毒和复制子系统、病毒-细胞融合实验、细胞-细胞融合实验、小鼠模型和人原代气道上皮细胞感染实验。
- 研究意义
- 研究提供了宿主防御冠状病毒的新见解，并表明DAZAP2是宿主导向抗病毒治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证候选基因的抗病毒活性
验证筛选出的前20个基因对SARS-CoV-2感染的影响
每个基因用两个独立sgRNA编辑A549-ACE2，用SARS-CoV-2 trVLP-Nluc感染，检测荧光素酶活性。
确认DAZAP2的泛冠状病毒限制作用
测试DAZAP2是否抑制不同属的冠状病毒感染
在DAZAP2编辑的A549-ACE2、HeLa-ACE2和MEF-ACE2细胞中感染来自四个属的冠状病毒，检测感染效率。
验证DAZAP2的过表达抑制病毒
确认DAZAP2的过表达是否抑制SARS-CoV-2感染
在A549-ACE2或MEF-ACE2中过表达人DAZAP2或鼠Dazap2，感染SARS-CoV-2，检测感染效率。
确定DAZAP2作用的病毒生命周期阶段
确定DAZAP2抑制病毒进入还是复制
使用假病毒系统测试DAZAP2敲除对SARS-CoV-2和VSV-G假病毒感染的影响。
内体进入途径分析
测试DAZAP2是否抑制内体进入途径
在存在E-64d和/或camostat mesylate的情况下，感染假病毒或trVLP-Nluc，检测感染效率。
病毒结合和内化测定
测试DAZAP2是否影响病毒结合或内化
结合测定：冰上孵育后qRT-PCR检测结合病毒量；内化测定：37°C孵育后蛋白酶K处理，qRT-PCR检测内化病毒量。
病毒粒子运输测定
测试DAZAP2是否影响病毒粒子向内溶酶体的运输
在E-64d存在下感染trVLP-Nluc 4小时，共聚焦显微镜检测刺突蛋白和核衣壳蛋白双阳性颗粒与LAMP1的共定位。
内体酸化测定
测试DAZAP2是否影响内体酸化
使用LysoSensor Green染料检测内体酸化。
刺突蛋白切割分析
测试DAZAP2是否影响刺突蛋白的切割
用假病毒孵育0、2、4小时，western blot检测S2'片段。
病毒-细胞融合实验
测试DAZAP2是否抑制病毒粒子与内溶酶体膜的融合
使用携带CypA-HiBit的假病毒，在表达LgBit的细胞中检测荧光素酶活性。
检测内溶酶体中病毒粒子和双链RNA
验证DAZAP2敲除后内溶酶体中病毒粒子减少和dsRNA增加
感染SARS-CoV-2 4小时，染色N蛋白和LAMP1，共聚焦显微镜计数共定位点；染色dsRNA，计数阳性细胞。
质膜进入分析
测试DAZAP2是否抑制质膜融合
细胞-细胞融合实验：293T供体细胞表达刺突蛋白，与受体细胞共培养，观察合胞体形成；使用split-NanoLuc检测融合；在表达TMPRSS2的细胞中用E-64d和camostat处理。
基因组复制分析
测试DAZAP2是否抑制病毒基因组复制
使用SARS-CoV-2复制子RNA电转染细胞，检测荧光素酶活性；qRT-PCR检测NSP10基因RNA水平。
初始翻译分析
测试DAZAP2是否影响病毒复制酶的初始翻译
使用修饰的复制子，在NSP1/2之间插入P2A-NanoLuc，并引入RdRp失活突变，电转染后检测荧光素酶活性。
机制研究
探索DAZAP2的抗病毒机制
检测DAZAP2是否为ISG，使用干扰素处理；检测DAZAP2定位；检测已知进入因子的表达量。
小鼠模型验证
验证DAZAP2基因敲除对SARS-CoV-2感染的影响
Dazap2基因敲除小鼠经鼻接种SARS-CoV-2，检测肺和鼻甲中的病毒载量和细胞因子表达。
人原代气道上皮细胞验证
验证DAZAP2在人原代气道上皮细胞中的抗病毒作用
人原代鼻和支气管上皮细胞经DAZAP2 sgRNA编辑，ALI分化后感染SARS-CoV-2，检测病毒RNA和病毒滴度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR筛选 | Brunello CRISPR敲除文库 | Addgene | #73178 |
| 基因编辑 | lentiCRISPR v2载体 | Addgene | #52961 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 转染 | Fugene HD转染试剂 | Promega | -- |
| 荧光素酶检测 | Nano-Glo荧光素酶检测试剂盒 | Promega | #N1110 |
| RNA转录 | mMESSAGE mMACHINE T7转录试剂盒 | Invitrogen | #AM1344 |
| 病毒包装 | psPAX2质粒 | Addgene | #12260 |
| pMD2.G质粒 | Addgene | #12259 | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Cell Signaling | #9806S |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | #S8830 | |
| Western blot | SuperSignal West Pico化学发光底物 | Thermo Fisher | -- |
| SuperSignal West Femto化学发光底物 | Thermo Fisher | -- | |
| 抗体 | DAZAP2抗体 | Santa Cruz | #sc-515182 |
| FLAG抗体 | Sigma | #F1804 | |
| HA抗体 | Abmart | #M20003M | |
| FURIN抗体 | Proteintech | #67481-1-Ig | |
| TMPRSS2抗体 | Abcam | #ab109131 | |
| CTSL抗体 | Thermo Fisher | #BMS1032 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | #20536-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | #60004-1-Ig | |
| HCoV-OC43 N抗体 | Sino Biological | #40643-T62 | |
| HCoV-NL63 N抗体 | Sino Biological | #40641-T62 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | Sigma | #A4416 | |
| 山羊抗兔二抗 | Thermo Fisher | #31460 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher | #A-21424 |
| 山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | #A21235 | |
| 山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | #A-11034 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 流式细胞术 | TrypLE消化液 | Thermo Fisher | #12605010 |
| ACE2抗体 | Sino Biological | #10108-RP01 | |
| AXL抗体 | R&D | #MAB154-SP | |
| DC-SIGN抗体 | Biolegend | #330102 | |
| TIM-1抗体 | Biolegend | #354002 | |
| SIGLEC1抗体 | Abcam | #ab199401 | |
| 硫酸乙酰肝素抗体(10E4) | USBiological | #H1890 | |
| 共聚焦显微镜 | SARS-CoV-2刺突蛋白抗体 | Sino Biological | #40591-T62 |
| LAMP1抗体 | Abcam | #ab24170 | |
| 双链RNA抗体(J2) | Scicons | #10010200 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | #15596018 |
| qRT-PCR | 一步法PrimeScript RT-PCR试剂盒 | TaKaRa | #RR064B |
| PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa | #RR047A | |
| TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa | #RR820A | |
| 荧光测定 | FlexStation 3多功能酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| 高内涵成像 | Operetta高内涵成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 共聚焦显微镜 | Leica共聚焦显微镜TCS SP8 | Leica | -- |
| 显微镜 | EVOS M7000显微镜 | AMG | -- |
| 流式细胞仪 | Attune NxT流式细胞仪 | Thermo | -- |
| 内体酸化测定 | LysoSensor Green染料 | Thermo | #L7535 |
| 细胞染色 | 瑞氏-吉姆萨染色液 | Sangon | #E607315 |
| 药物处理 | E-64d | -- | -- |
| 甲磺酸卡莫司他 | -- | -- | |
| 瑞德西韦 | -- | -- | |
| 氯喹 | -- | -- | |
| 重组蛋白 | 人DAZAP2 cDNA | Sino Biological | #HG15906-G |
| 小鼠Dazap2 cDNA | Sino Biological | #MG52462-G | |
| 细胞培养 | IV型胶原酶 | Gibco | #17104019 |
| Ham's F12培养基 | Gibco | #11765054 | |
| 细胞分化 | PneumaCult-ALI培养基 | StemCell Technologies | #05001 |
| 蛋白表达 | pLV-EF1α-IRES-puro载体 | Addgene | #85132 |
| HIV包装 | pCAGGS载体 | -- | -- |
| pMIG载体 | -- | -- | |
| 蛋白合成 | PH-Halo-LgBiT片段 | GENEWIZ | -- |
| CypA-HiBiT片段 | GENEWIZ | -- | |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | Brunello文库（Addgene #73178）；A549-ACE2-Cas9细胞；MOI ~0.3；trVLP-GFP感染MOI 0.5 24小时；FACS分选GFP阳性细胞 阅读提示：Materials and Methods: Genome-wide CRISPR knockout screen; Figure 1A legend |
| 病毒扩增与滴度 | Vero E6细胞培养；病毒株来源；病灶形成实验 阅读提示：Materials and Methods: Cells and viruses |
| 假病毒感染实验 | MLV假病毒包装；刺突蛋白表达质粒；感染体积30 μL；感染时间24小时；荧光素酶检测 阅读提示：Materials and Methods: Pseudotyped virus experiment; Figure 2A-C legends |
| 内体进入实验 | E-64d浓度100 μM；camostat mesylate浓度100 μM；感染时间14或24小时 阅读提示：Materials and Methods: Cells and viruses; Figure 2D-E legends |
| 病毒-细胞融合 | CypA-HiBit假病毒；LgBit表达细胞；感染时间8小时 阅读提示：Materials and Methods: Virus-cell fusion assay; Figure 2M legend |
| 复制子实验 | 复制子RNA电转染；remdesivir 10 μM；检测时间点 阅读提示：Materials and Methods: Generation of SARS-CoV-2 replicon system; Figure 4A legend |
| 小鼠实验 | 小鼠品系、年龄（10-12周）、性别（雌性）；病毒株（MA17、Beta、SH01）；接种剂量（1,000或50 FFU；50,000 FFU）；感染天数（1或3天） 阅读提示：Materials and Methods: Mouse experiments; Figure 5B-G legends |
| 人原代细胞感染 | HNEC/HBEC分离；ALI分化20天；病毒接种量40,000 FFU；感染后24/48小时检测 阅读提示：Materials and Methods: Preparation of HNEC and HBEC in vitro models; Figure 5J-L legends |