验证HSV-1感染激活MAPK/JNK通路
确认HSV-1感染是否诱导JNK等MAPK的磷酸化激活。
HeLa细胞感染HSV-1（MOI=0.3）不同时间点，免疫印迹检测JNK、p38、ERK磷酸化水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
应激激活蛋白激酶JNK应答单纯疱疹病毒-1感染协调BRD4从染色体结合到转录延伸的转变
Activation of the stress-activated protein kinase JNK in response to herpes simplex virus-1 infection coordinates transition of BRD4 from chromosome association to transcription elongation.
实验完整度
高包含体外细胞感染模型（HeLa、JNK敲除、siRNA）、生化分析（免疫共沉淀、分级分离、ChIP-qPCR）及体内小鼠模型（急性感染和潜伏期再激活）的功能和机制验证。
主要模型
HeLa细胞（HSV-1感染模型） JNK1/2敲除HeLa细胞 Balb/C小鼠角膜划痕感染模型 Balb/C小鼠潜伏感染模型
重点核对
HSV-1感染MOI（0.3或1）及感染时间 JNK抑制剂SP600125浓度（5、10 μM）及处理时间 JNK1/2敲除HeLa细胞及siRNA敲低 HMBA浓度（3 mM）及处理时间 bortezomib剂量（1.5 mg/kg）及给药途径（ip）
摘要
c-Jun N末端激酶（JNK）信号通路是单纯疱疹病毒1型裂解性感染和潜伏期再激活所必需的。JNK信号通过转录调控调节细胞对应激的反应。然而，JNK调节HSV-1感染的机制尚不明确。我们在此证明，HSV-1感染触发BRD4从染色体结合向转录调控的转变以促进病毒感染。具体而言，HSV-1感染诱导JNK激活，JNK激活介导了表观遗传阅读蛋白BRD4从靶向染色质向与转录调控蛋白结合的再分布。BRD4通过与正性转录延伸因子P-TEFb形成复合物并关联病毒DNA，转变为病毒感染的调控。通过化学抑制剂或siRNA对JNK进行基因敲除或干扰，会阻碍BRD4的释放并抑制HSV-1感染。已知化疗药物和辐射均可促进JNK激活和HSV再激活。我们进一步表明，JNK激动剂或已知可激活JNK的化疗药物能够增强HSV-1感染。我们的研究揭示了JNK通过应激诱导的BRD4功能从宿主染色体结合向病毒基因表达的转变来调节HSV-1感染的新机制。该工作将化疗药物引起的复发性HSV感染与JNK激活联系起来。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- JNK信号通路如何调控HSV-1裂解性感染及再激活？
- 核心机制
- HSV-1感染激活JNK，促进BRD4从染色体结合释放，转移到转录调控，与P-TEFb和RNA Pol II形成复合物并关联病毒DNA，从而促进病毒基因转录。
- 主要证据
- 使用HeLa细胞、JNK敲除细胞、siRNA和化学抑制剂证明JNK激活对HSV-1感染和BRD4释放的必要性；通过免疫共沉淀和ChIP-qPCR显示BRD4与P-TEFb、Pol II形成复合物并富集于病毒基因启动子；体内小鼠模型证明bortezomib促进HSV-1感染和再激活。
- 研究意义
- 揭示了JNK通过BRD4功能转变调控HSV-1感染的新机制，并为化疗药物引起的病毒再激活提供了机制联系，可能对临床管理具有意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证JNK对HSV-1感染的必要性
检测JNK活性对HSV-1感染的影响。
使用JNK抑制剂SP600125处理或JNK1/2敲除HeLa细胞，检测HSV-1蛋白（ICP4）表达和病毒滴度，并通过外源表达JNK进行回补。
验证HSV-1感染诱导BRD4释放并依赖JNK
检测HSV-1感染是否导致BRD4从染色质释放，并验证其依赖JNK。
使用细胞分级分离实验检测BRD4在低盐组分（LSF）和低盐提取核组分（LSEN）中的分布，并用SP600125或siRNA处理验证JNK的作用。
验证BRD4-P-TEFb-Pol II复合物形成及病毒DNA结合
确认HSV-1感染是否促进BRD4与转录延伸因子复合物的形成并关联病毒DNA。
通过免疫共沉淀检测BRD4与CDK9（P-TEFb亚基）和Pol II（Rpb-1）的相互作用，并使用改良的ChIP-qPCR检测BRD4等蛋白在病毒基因启动子区域的富集。
验证JNK激动剂和化疗药物增强HSV-1感染
测试JNK激动剂及化疗药物是否能通过激活JNK增强HSV-1感染。
感染细胞后分别用JNK激动剂（如anisomycin）和化疗药物（cisplatin、paclitaxel、bortezomib、HMBA）处理，检测JNK磷酸化、病毒蛋白表达和病毒滴度；并用SP600125抑制验证JNK依赖性。
体内验证bortezomib对HSV-1感染和再激活的影响
在动物模型中验证JNK激活剂bortezomib是否促进HSV-1急性感染和潜伏期再激活。
Balb/C小鼠角膜划痕感染HSV-1后给予bortezomib，检测泪液病毒DNA和滴度、脑组织病理及脑内JNK磷酸化；在潜伏感染模型中检测三叉神经节病毒基因表达和LAT水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | -- | |
| JNK抑制 | SP600125（JNK抑制剂） | -- | -- |
| p38抑制 | SB203580（p38抑制剂） | -- | -- |
| ERK途径抑制 | U0126（ERK途径抑制剂） | -- | -- |
| JNK激活 | 茴香霉素 | -- | -- |
| 化疗药物 | 顺铂 | Selleck Chemicals | -- |
| 紫杉醇 | -- | -- | |
| 硼替佐米 | Selleck Chemicals | -- | |
| 抗病毒对照 | 阿昔洛韦 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白检测 | JNK1/2抗体 | BD Bioscience | 554285 |
| p38抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| Erk2抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 磷酸化MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| Rpb-1 CTD抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| CDK9抗体 | Santa Cruz | sc-13130 | |
| BRD4抗体 | Abcam | ab128874 | |
| Lamin B1抗体 | Beyotime | AF5222 | |
| ICP0抗体 | Santa Cruz | sc-53070 | |
| GAPDH抗体 | Bioworld Technology | MB001 | |
| HEXIM1抗体 | Cell Signaling Technology | 9064 | |
| FLAG抗体 | Beyotime | AF519 | |
| 质粒构建 | pcDNA5-CMV-FLAG-BRD4野生型质粒 | Miaoling | P29409 |
| pcDNA5-CMV-FLAG-BRD4-T1186A/T1212A突变体质粒 | GenScript | -- | |
| 免疫沉淀 | Protein A/G琼脂糖珠 | Beyotime | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Life Technologies | -- |
| DNA/RNA提取 | MiniBEST病毒RNA/DNA提取试剂盒 | TaKaRa | 9766 |
| 逆转录 | HiScript逆转录预混液 | Vazyme | R323-01 |
| qPCR | SYBR Green PCR预混液 | Vazyme | Q141-02/03 |
| ABI 7300实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 显微镜 | Olympus VS200玻片扫描仪 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HSV-1感染 | MOI、感染时间、细胞类型 阅读提示：Methods 'Cells and virus' 和 'Infection and titration assay' |
| JNK抑制 | SP600125浓度（5,10μM）、处理时间（1h预先处理） 阅读提示：Figure 1B 图注和Methods 'Infection and titration assay' |
| JNK敲除 | JNK1/2敲除HeLa细胞构建方法、sgRNA序列 阅读提示：Methods 'Cells and virus' |
| BRD4释放检测 | 细胞分级分离方法（buffer组成、提取次数） 阅读提示：Methods 'Fractionation assay' |
| 复合物形成检测 | 免疫共沉淀抗体、样本制备 阅读提示：Methods 'Immunoprecipitation and immunoblotting studies' |
| 病毒DNA结合检测 | ChIP-qPCR方法、引物序列 阅读提示：Methods 'Chromatin immunoprecipitation (ChIP)' 和 Table S1 |
| 动物实验 | 小鼠品系、HSV-1感染剂量及途径、bortezomib剂量及给药方案、UVB剂量 阅读提示：Methods 'Animal studies' |