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        组织蛋白酶D通过稳定抗凋亡蛋白促进急性髓系白血病进展

        Cathepsin D promotes acute myeloid leukemia progression through stabilization of the anti-apoptotic proteins.

        作者信息Huimin Jiang, Yongjian Wang, Churan Wang, Lu Yang, Shujuan Wang, Feng Wang, Situ Xue, Zhuan Zhang, Haigen Fu, Ting Dong, Jian Yuan, Zhuorong Li, Ke Li
        PMID40796615
        期刊Cell Death Dis
        发布时间2025-08-12
        DOI10.1038/s41419-025-07949-7
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含细胞系体外实验、动物模型（U937异种移植、MLL-AF9模型）及患者样本，并进行了功能验证和机制验证（泛素化、蛋白稳定性）。

        主要模型

        人AML细胞系（U937、MV4-11、MOLM-13） NSG小鼠U937异种移植模型 C57BL/6小鼠MLL-AF9白血病模型 原代AML患者细胞

        重点核对

        CTSD敲低效率及对BCL2、BCL-XL、MCL1蛋白和mRNA水平的影响 TRIM21敲低对CTSD敲低细胞凋亡和增殖的回复效应 N-8处理对CTSD依赖性和TRIM21依赖性的验证 CHX和MG132处理对蛋白半衰期和泛素化的影响 N-8在U937和MLL-AF9模型中的给药剂量和给药方式

        摘要

        组织蛋白酶D（CTSD）是一种溶酶体天冬氨酸蛋白酶，在调节实体瘤的特性（包括增殖、凋亡、迁移、转移和血管生成）中发挥重要作用。然而，CTSD在血液恶性肿瘤中的功能在很大程度上仍然未知。在此，我们展示CTSD在急性髓系白血病（AML）中高表达，且CTSD高表达与不良预后相关。在AML细胞中敲低CTSD可抑制细胞增殖和抗凋亡活性。机制上，CTSD降低了E3泛素连接酶TRIM21的表达，后者介导抗凋亡蛋白BCL2、BCL-XL和MCL1的泛素化和降解。通过遗传学或小分子抑制剂N-8抑制CTSD表达，可加速BCL2、BCL-XL和MCL1的降解，从而降低其蛋白水平。N-8在venetoclax敏感和耐药模型中均显示出根除AML的显著功效。总之，我们的研究揭示了CTSD在白血病进展中的作用，并强调靶向CTSD作为AML潜在治疗策略。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        CTSD在急性髓系白血病（AML）中的表达水平、预后相关性及其在AML进展中的作用和潜在机制是什么？
        核心机制
        CTSD通过降低E3泛素连接酶TRIM21的蛋白水平，抑制TRIM21介导的BCL2、BCL-XL和MCL1的泛素化和降解，从而稳定这些抗凋亡蛋白，促进AML细胞增殖和存活。
        主要证据
        基于CPTAC/GEPIA/UALCAN数据库分析CTSD表达与预后；通过siRNA/shRNA敲低CTSD在细胞系和异种移植模型中验证功能；通过免疫共沉淀、泛素化实验和蛋白质组学等揭示CTSD-TRIM21-BCL2/BCL-XL/MCL1调控轴。
        研究意义
        作者提出CTSD是AML的潜在治疗靶点，尤其有助于克服耐药；小分子抑制剂N-8在体内外显示潜力，可作为先导化合物进行药物开发。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        CTSD表达与AML临床相关性分析

        评估CTSD在AML中的表达水平及其与预后的关系。

        利用CPTAC、GEPIA和UALCAN数据库分析CTSD在AML中的表达及与生存的相关性；在AML细胞系中检测CTSD蛋白水平。

        2

        CTSD敲低对AML细胞功能的影响

        验证CTSD对AML细胞增殖和凋亡的作用。

        通过siRNA和shRNA敲低CTSD，检测细胞增殖和凋亡；进行回补实验。

        3

        CTSD敲低对AML体内进展的影响

        在动物模型中验证CTSD对AML进展的影响。

        将CTSD敲低的U937细胞移植到NSG小鼠中，检测白血病负荷和凋亡。

        4

        CTSD调控BCL2等抗凋亡蛋白的机制研究

        阐明CTSD敲低导致抗凋亡蛋白减少的分子机制。

        定量蛋白质组学分析差异蛋白；检测BCL2、BCL-XL、MCL1的蛋白和mRNA水平、半衰期和泛素化；筛选E3连接酶并验证TRIM21的作用。

        5

        虚拟筛选CTSD抑制剂及活性验证

        发现靶向CTSD的小分子抑制剂并评估其活性。

        使用Discovery Studio 3.0进行基于结构的虚拟筛选，从中选出候选化合物，通过SPR和细胞实验验证活性，确定N-8为最优先导化合物。

        6

        N-8对AML细胞和耐药细胞的功能及机制验证

        验证N-8的抗AML作用及其机制。

        检测N-8对AML细胞凋亡和增殖的影响，及对BCL2等蛋白水平和稳定性的影响；在CTSD敲低或TRIM21敲低细胞中验证其特异性。

        7

        N-8在体内模型中的治疗效果评估

        在动物模型中验证N-8的疗效和安全性。

        在U937异种移植模型和MLL-AF9模型中给予N-8治疗，检测白血病负荷、凋亡、生存期及毒副作用。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        蛋白质印迹实时荧光定量PCR
        验证细胞功能变化
        流式细胞术CCK-8法
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹实时荧光定量PCR
        验证免疫效应
        流式细胞术
        验证机制链路
        免疫共沉淀泛素化检测表面等离子体共振
        评估体内效果
        小鼠异种移植模型MLL-AF9白血病模型Kaplan-Meier生存分析
        数据分析与统计
        分子对接定量蛋白质组学学生t检验方差分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养RPMI 1640培养基EallBio03.4007C
        胎牛血清EallBio03.U16001DC
        青霉素-链霉素TransGene BiotechFG101-01
        杜氏改良Eagle培养基EallBio03.1002C
        患者样本处理人淋巴细胞分离液SolarbioP8610
        细胞筛选嘌呤霉素GibcoA1113802
        小鼠模型造血干/祖细胞富集试剂盒StemCell19856A
        细胞增殖检测CCK-8试剂盒TargetMolC0005
        免疫共沉淀Protein A/GSanta Cruz Biotechnologysc-2003
        蛋白质提取RIPA裂解液ApplegenC1053
        蛋白定量BCA蛋白定量试剂盒Applegen1511
        Western blotPVDF膜----
        Tanon 5200化学发光成像系统Tanon--
        RNA提取RNA提取试剂盒ES scienceRN001
        逆转录NovoScript Plus 全能型第一链cDNA合成预混液NovoproteinE047
        实时定量PCRNovoStart SYBR qPCR预混液NovoproteinE096-01A
        MyCycler热循环仪qTOWER, Analytik Jena844-00553-2
        流式分析PE/Cyanine7抗人CD45抗体Biolegend368532
        凋亡检测Annexin V-APCDojindoAD11
        流式分析流式细胞仪Beckman CoulterA00-1-1102
        分子对接Discovery Studio 3.0----
        质粒转染聚乙烯亚胺Kyfora Bio24765
        siRNA转染Lipofectamine RNAiMAX转染试剂Thermo Fisher Scientific13778030
        药物处理MG132SelleckS2619
        药物溶解二甲基亚砜SolarbioD8372
        动物实验磷酸盐缓冲液LivningLVN10022
        Western blot抗CTSD抗体Abcamab75852
        抗FBXW7抗体Abcamab192328
        抗BCL2抗体AbclonalA0208
        抗BCL-XL抗体Proteintech10783-1-AP
        抗MCL1抗体Proteintech16225-1-AP
        抗PELI1抗体Proteintech12053-1-AP
        抗TRIM21抗体Proteintech67136-1-Ig
        抗β-肌动蛋白抗体Proteintech20536-1-AP
        抗ITCH抗体Cell Signaling TechnologyD8Q6D
        抗GAPDH抗体ZSGB-BIOTA-08
        抗Myc标签抗体MBL BIOTECH562
        抗DDDDK标签抗体MBL BIOTECHPM020
        抗HA标签抗体MBL BIOTECH561

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        细胞培养
        细胞系来源：HL60、Kasumi、U937、MV4-11、KG1、OCI-AML3、MOLM-13、NB4和Lenti-X 293T的培养基及添加物浓度；培养条件：37°C、5% CO2
        阅读提示：Methods: Cell lines
        CTSD敲低实验
        siRNA/shRNA序列及转染方法；敲低效率验证；用于回复实验的CTSD过表达质粒
        阅读提示：Methods: Generation of Stable cell lines; Plasmids and transfection; Supplementary Table 2
        体内实验
        小鼠品系（NSG和C57BL/6J）、周龄、性别；细胞移植数量；N-8给药剂量（20 mg/kg和30 mg/kg）和给药途径（PO），Ara-C剂量和途径，venetoclax剂量和途径；治疗周期；每组样本量（n=5）
        阅读提示：Methods: Murine Xenograft Model of Leukemia; Figure 6 legend
        药物处理
        N-8的溶解条件（corn oil with 2% DMSO）；CHX和MG132的处理浓度和时间（CHX 20 μg/mL，MG132 10 μM，处理时间标注）
        阅读提示：Methods: Reagents and antibodies; Figure 5H
        蛋白检测
        抗体稀释度未明确说明；蛋白裂解液配方和提取方法；BCA定量和Western blot步骤
        阅读提示：Methods: Coimmunoprecipitation and Western blotting; Reagents and antibodies

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