鉴定PRRX1相互作用蛋白
发现PRRX1的新结合伙伴
使用稳定表达FLAG-PA或FLAG-PB的胶质瘤起始细胞和U2OS细胞进行亲和纯化，结合质谱分析。
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同源结构域蛋白PRRX1锚定Ku异二聚体于DNA双链断裂处以促进非同源末端连接
Homeodomain protein PRRX1 anchors the Ku heterodimers at DNA double-strand breaks to promote nonhomologous end-joining.
实验完整度
高包含体外蛋白相互作用、细胞功能实验（NHEJ/HR报告基因）、动物模型（Prrx1基因敲除小鼠）、患者样本分析及体内外机制验证，涵盖多重证据层级。
主要模型
人胚肾HEK293T细胞系 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs，野生型及Prrx1敲除） 人骨肉瘤U2OS细胞系 人胃腺癌细胞系Hs746T TCGA胃腺癌（STAD）临床队列
重点核对
PRRX1的NRR基序（Asn144/Arg145/Arg146）对Ku70和DNA结合均关键 PRRX1寡聚化界面（α1螺旋，Glu110/Arg111）对NHEJ功能必需 竞争性肽（40 μM）处理抑制PRRX1寡聚化并降低NHEJ效率 Prrx1基因敲除小鼠MEFs在辐照或ETP处理后染色质上Ku70/80和DNA-PKcs富集减少 STAD患者PRRX1低表达与基因组不稳定相关（TCGA数据）
摘要
DNA依赖性蛋白激酶（DNA–PK）复合物在非同源末端连接（NHEJ）中发挥关键作用，NHEJ是修复DNA双链断裂（DSBs）的不依赖模板的通路。Ku70/80与DSB末端的结合促进了DNA–PK全酶的组装。然而，DNA–PK在断裂DNA末端附着和稳定的关键机制仍不清楚。在这里，我们确定PRRX1（一种含有同源结构域的蛋白）是DNA–PK染色质定位和随后激活的介质。PRRX1寡聚化以同时结合双链DNA和Ku70的SAP（SAF-A/B、Acinus和PIAS）结构域，从而增强Ku在DSB处的锚定并稳定DNA–PK以实现有效的NHEJ修复。PRRX1表达降低或致病性突变与基因组不稳定和NHEJ修复受损相关。此外，一种破坏PRRX1寡聚化的肽可损害NHEJ效率并降低辐照后的细胞存活。这些发现为NHEJ机制的激活提供了新见解，并为优化癌症治疗提供了潜在策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DNA-PK复合物在断裂DNA末端的附着和稳定是如何精确调控的？
- 核心机制
- PRRX1通过其HD结构域中的NRR基序同时结合dsDNA和Ku70的SAP结构域，并通过其N端α1螺旋介导的寡聚化，增强Ku在DSB处的锚定，稳定DNA-PK全酶，从而促进NHEJ修复。
- 主要证据
- 体外下拉实验验证PRRX1与Ku70直接结合；染色质分级和激光微照射实验显示PRRX1促进Ku70/80和DNA-PKcs在损伤位点的募集；激酶实验证明PRRX1增强DNA-PK活性；NHEJ报告基因实验显示PRRX1过表达促进NHEJ，而敲低或突变抑制。
- 研究意义
- 本研究揭示了同源结构域蛋白在调控NHEJ中的新作用，并为癌症治疗策略的开发提供了潜在靶点，特别是针对特定亚型胃腺癌的放疗增敏。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PRRX1与Ku70直接结合
确认PRRX1与Ku70在体外直接互作
用重组MBP-PRRX1与GST-Ku70/80、His-Ku70/80异二聚体进行MBP pull-down实验。
定位PRRX1相互作用结构域
确定PRRX1和Ku70中介导互作的具体区域
构建PRRX1截短体和点突变体，进行MBP pull-down实验；根据AlphaFold模型和ClusPro进行分子对接预测。
检测PRRX1在DNA损伤位点的募集
评估PRRX1能否被招募至DNA损伤位点
使用激光微照射（LMI）结合活细胞成像或免疫荧光，观察PRRX1在损伤条带的积累，并检测其与γH2AX共定位。
验证PRRX1直接结合dsDNA
确定PRRX1是否直接与DNA结合及其特异性
使用生物素标记的不同形式DNA（ssDNA、平末端、3'或5'突出dsDNA）进行DNA pull-down实验；EMSA和MST实验测定结合亲和力。
检测PRRX1对Ku和DNA-PKcs染色质招募的影响
验证PRRX1是否促进DNA-PK复合物在染色质上的组装
在野生型或Prrx1敲除MEF及PRRX1过表达U2OS细胞中，经辐照或ETP处理后提取染色质组分，免疫印迹检测Ku70/80和DNA-PKcs；用免疫荧光观察53BP1焦点；用ChIP检测I-SceI诱导的DSB位点Ku70富集。
检测PRRX1对DNA-PK激酶活性的影响
评估PRRX1是否能直接增强DNA-PK活性
体外DNA-PK激酶实验，使用重组C-MYC作为底物，加入PRRX1蛋白和dsDNA，检测MYC的磷酸化水平。
功能评估PRRX1对NHEJ和HR的影响
确定PRRX1是否特异性地调节NHEJ修复效率
使用EJ5-GFP和DR-GFP报告系统，在PRRX1敲低或过表达的U2OS细胞中检测报告基因表达，并用NU7441或Olaparib处理以区分通路。
研究PRRX1寡聚化及其功能相关性
验证PRRX1寡聚化是否是其同时结合Ku和DNA并促进NHEJ的基础
通过co-IP、MBP pull-down和native PAGE检测PRRX1的自相互作用；构建寡聚化缺陷突变体，测试其NHEJ报告基因活性。
评估PRRX1对基因组稳定性的影响
明确PRRX1缺失是否导致基因组不稳定
在野生型和Prrx1敲除MEFs中检测细胞存活、γH2AX焦点、染色体断裂、微核和胞质dsDNA，以及cGAS-STING通路相关蛋白的磷酸化。
分析PRRX1在肿瘤中的表达与突变
研究PRRX1表达水平或突变与基因组不稳定及NHEJ缺陷的关联
使用TCGA STAD队列分析wGII、基因组疤痕（LOH、LST、TAI）及生存；从ICGC数据库获取突变信息；体外验证R145Q突变的功能。
开发并验证干扰PRRX1寡聚化的肽
评估靶向PRRX1寡聚化的肽抑制剂是否影响NHEJ和细胞存活
合成竞争性肽和突变对照肽，检测其对PRRX1自结合、NHEJ效率、γH2AX焦点、DNA-PKcs磷酸化和细胞存活的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | Pricella | PM150710 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Gibco | C11995500CP | |
| 胎牛血清 | NEWZERUM | FBS-S500 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 药物处理 | 依托泊苷 | Sigma-Aldrich | E1383 |
| 喜树碱 | Sigma-Aldrich | C9911 | |
| 细胞同步化 | 胸苷 | Sigma-Aldrich | T1895 |
| 病毒转导 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR-1003 |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Selleckchem | S7417 |
| 药物处理 | KU55933 | Selleckchem | S1092 |
| NU7441 | Selleckchem | S2638 | |
| 奥拉帕尼 | Selleckchem | S1060 | |
| Mirin | MedChemExpress | HY-117693 | |
| 细胞转染 | 聚乙烯亚胺 | Sigma | 919012 |
| 细胞培养 | 秋水仙素 | Beyotime | ST-1173 |
| 蛋白纯化 | Ni-IDA 6FF树脂 | -- | -- |
| 直链淀粉树脂 | -- | -- | |
| 谷胱甘肽琼脂糖珠 | -- | -- | |
| DNA pull-down | 链霉亲和素琼脂糖 | Invitrogen | S951 |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G磁珠 | Bimake | B23202 |
| 抗FLAG亲和琼脂糖凝胶 | Bimake | B23012 | |
| 细胞存活实验 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0038 |
| RNA提取 | RNAiso Plus试剂 | TAKARA | 9109 |
| 逆转录 | HiScript II Q RT SuperMix | Vazyme | R222-01 |
| RT-qPCR | SYBR Green qPCR混合液 | Monad | MQ00801S |
| DNA-PK激酶实验 | DNA-PK激酶试剂盒 | Promega | V4106 |
| γ-32P-ATP | PerkinElmer | NEG502A100UC | |
| ATP | Solarbio | A9130 | |
| 重组C-MYC蛋白 | HCUSABIO | CSB-EP015270HU | |
| 重组蛋白表达 | 异丙基β-D-硫代半乳糖苷 | -- | -- |
| 重组蛋白 | His-Ku70/80异二聚体 | Sino Biological | CT018-H07B |
| NHEJ报告基因 | pimEJ5GFP报告质粒 | miaolingbio | P31613 |
| HR报告基因 | pDRGFP报告质粒 | -- | -- |
| NHEJ报告基因 | I-SceI大范围核酸酶 | NEB | R0694S |
| 凝胶电泳 | 6× DNA上样缓冲液 | NEB | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系名称、来源、培养条件（培养基、血清浓度）、处理药物及剂量（如ETP 10 μM、CPT、IR剂量） 阅读提示：Materials and methods - Cell cultures |
| 蛋白相互作用实验 | 重组蛋白浓度、缓冲液组成、孵育时间与温度、洗涤次数 阅读提示：Materials and methods - In vitro pull-down assay |
| 激光微照射与成像 | 激光波长、功率、照射时间、细胞系、质粒表达时间、成像时间点 阅读提示：Materials and methods - Irradiation, laser micro-irradiation, and live imaging |
| NHEJ报告基因实验 | 报告质粒浓度、共转染比例、药物处理时间、流式细胞仪设置、GFP阳性细胞门控策略 阅读提示：Materials and methods - NHEJ and HR reporter assays |
| 动物实验 | 小鼠品系、基因敲除策略、动物伦理审批编号 阅读提示：Materials and methods - Animals and genotyping |
| 染色质分级与免疫沉淀 | 裂解缓冲液组成、离心速度与时间、抗体及浓度、洗涤条件 阅读提示：Materials and methods - Chromatin fractions extraction, Immunoblotting and immunoprecipitation |
| 激酶实验 | DNA-PK酶量、底物浓度、ATP浓度、放射性标记、孵育时间与温度 阅读提示：Materials and methods - DNA–PK kinase assay |
| 细胞存活实验 | 细胞接种密度、处理时间（96 h）、CCK-8试剂盒使用步骤、吸光度测量波长 阅读提示：Materials and methods - Cell survival assay |
| 肽处理实验 | 肽序列、纯度、储存液浓度、工作浓度（40 μM）、处理时间 阅读提示：Materials and methods - Peptides |
| TCGA数据分析 | 数据下载版本、分组方法（中位数或分位数）、wGII和基因组疤痕的计算方法、生存分析参数 阅读提示：Materials and methods - wGII, genomic scar signature, and survival analyses |