RNA提取与cDNA合成
获取犬脾脏B细胞的总RNA并合成cDNA，作为扩增抗体可变区基因的模板。
使用Qiagen试剂盒从犬脾脏组织提取总RNA，并通过Omniscript逆转录试剂盒合成cDNA，使用特异性引物引导合成。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
开发犬单链噬菌体抗体文库以分离用于转化癌症研究的重组抗体
The development of a canine single-chain phage antibody library to isolate recombinant antibodies for use in translational cancer research.
实验完整度
中文献包含明确的实验方法（文库构建、筛选、IgG表达）及验证结果（ELISA、免疫印迹、表位作图），但主要基于方法学层面的验证，未在动物模型或患者样本中进行功能验证。
主要模型
犬脾脏B细胞mRNA来源的scFv噬菌体文库 EGFP和mCHERRY模型蛋白筛选体系 犬PD-1蛋白筛选体系 ExpiCHO细胞表达体系
重点核对
5'RACE PCR扩增犬B细胞mRNA时使用的反向引物CH、Cκ、Cλ序列 用于克隆重链和轻链可变区的简并引物组及对应的限制性酶切位点 scFv文库构建中采用的'一锅法'连接策略以及轻链lambda和kappa链的比例 生物淘选过程中抗原包被浓度、洗涤次数和洗脱方法（高pH三乙胺） PD-1 IgG表达时使用ExpiCHO系统及转染后的收获时间（第10和12天）
摘要
单克隆抗体是癌症治疗中的重要药物。自发性犬肿瘤可与相应的人类疾病共享临床特征。Lisowska等人报道了用于分离免疫耐受抗体的犬抗体文库的开发。该方法的数据可能有助于加速和多样化治疗性抗体的开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何构建一个高多样性的犬源scFv噬菌体展示文库，并利用该文库分离犬免疫耐受的单克隆抗体，以用于转化癌症研究。
- 核心机制
- 通过5'RACE PCR捕获犬B细胞mRNA的体细胞突变可变区，经简并引物扩增克隆至持留文库，并通过组合连接形成scFv文库，利用噬菌体展示和生物淘选富集特异性抗体。
- 主要证据
- 使用长读长测序对scFv文库进行注释，验证了文库的多样性及IGHV/IGLV/IGKV亚家族分布；通过短读长测序评估生物淘选后CDR3序列的富集；成功从文库中分离出靶向犬PD-1的scFv，并转换为有活性的嵌合IgG。
- 研究意义
- 该平台可用于克隆和存档抗体可变区基因，为开发犬类自发性肿瘤的免疫耐受模型以及宠物和人类疾病治疗提供资源。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
5'RACE PCR扩增可变区基因
捕获犬B细胞mRNA中表达的可变区序列的完整信息，包括5'端和FR1区域。
使用SMARTer RACE试剂盒进行5'RACE PCR，利用恒定区反向引物扩增重链和轻链可变区，产物克隆至pGEM-T载体并测序设计简并引物。
构建重链和轻链持留文库
将扩增的可变区基因克隆至持留载体，长期保存并方便后续组合构建scFv文库。
重链可变区经NcoI和AscI酶切后克隆至pIHV-1载体，形成pGEMP17持留文库；轻链可变区经MluI和NotI酶切后克隆至含固定重链的pGEMP17载体，形成pGEMP18文库。
构建scFv噬菌体文库
将重链和轻链持留文库组合连接，形成展示在M13噬菌体表面的scFv文库。
用AscI和NotI酶切重链持留文库质粒，轻链扩增产物经MluI和NotI酶切后，连接形成含15氨基酸接头的scFv基因，并与gIII蛋白融合。
文库质量评估与多样性分析
通过测序评估文库的克隆效率、片段完整性、基因家族分布和CDR多样性。
使用长读长测序分析持留文库和scFv文库的插入率、PelB和Myc标签存在情况，并计算CDR长度分布；使用短读长测序分析FR3-CDR3多样性。
生物淘选筛选特异性抗体
从scFv文库中富集针对特定靶标蛋白的抗体，并评估其特异性。
使用EGFP和mCHERRY蛋白作为模型进行传统免疫管筛选；使用犬EGFR肽段和犬PD-1蛋白进行微型化筛选；通过ELISA和免疫印迹验证阳性克隆。
scFv向IgG的转化及功能验证
验证从文库中筛选出的scFv能否在哺乳动物细胞中表达为有活性的IgG。
将抗PD-1 scFv可变区与小鼠IgG2a恒定区融合，构建单顺反子表达质粒（含2A肽），转染ExpiCHO细胞，表达后通过ELISA和表位作图验证活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | RNAeasy微型试剂盒 | Qiagen | 74704 |
| RNaseZap溶液 | Sigma | R2020 | |
| cDNA合成 | Omniscript逆转录试剂盒 | Qiagen | 205113 |
| 5'RACE PCR | SMARTer RACE扩增试剂盒 | Clontech | NC0734706 |
| PCR扩增 | 高保真Phusion预混液 | New England Biolabs | M0531L |
| PCR产物纯化 | Qiagen PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 |
| 克隆 | pGEM-T easy载体 | Promega | A1360 |
| XL1-Blue细菌细胞 | Agilent | 200249 | |
| DH5a细菌细胞 | Thermo Fisher | EC0112 | |
| TG1细菌细胞 | Lucigen | 60502-2 | |
| 噬菌体展示 | M13K07辅助噬菌体 | New England Biolabs | -- |
| 表位作图 | Ph.D.-12噬菌体展示肽库 | New England Biolabs | E8110 |
| 蛋白纯化 | Protein A树脂-Amintra | Abcam | ab270308 |
| ELISA | 96孔白色平底聚苯乙烯高结合微孔板 | Corning | 3922 |
| 生物淘选 | 镍NTA琼脂糖珠 | Qiagen | 30210 |
| 蛋白G Sepharose珠 | Cytiva | 17061801 | |
| 抗体检测 | HRP偶联抗M13抗体 | Santa Cruz | sc-53004HRP |
| IgG检测 | HRP偶联兔抗鼠二抗 | DAKO/AGILENT | P0260 |
| 山羊抗狗IgG H&L (HRP) | Abcam | ab112852 | |
| 蛋白表达 | ExpiCHO表达系统试剂盒 | Thermo Scientific | A29133 |
| 蛋白 | PD-1蛋白（His、Fc标签） | Sino Biologics | 70109-D08H, 70109-D02H |
| 试剂 | 胰蛋白酶 | Sigma | T1426-50MG |
| 聚乙二醇8000 | VWR | 0159-500G | |
| 链霉亲和素 | Cambridge Bioscience | ANA60659 | |
| 糖原 | Roche | 109013930010 | |
| MPAGE 4X LDS样品缓冲液 | Merck | MPSB-10ML | |
| 设备 | MicroPulser电穿孔仪 | BIORAD | 1652100 |
| 电穿孔比色杯 | BIORAD | 1652809 | |
| Fluoroskan酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| Nanodrop分光光度计 | Thermo Fisher | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RNA提取 | 脾脏组织来源（5只匿名犬），RNA提取方法（Qiagen试剂盒），匀浆和蛋白酶K处理条件 阅读提示：STAR Methods, RNA isolation |
| cDNA合成 | 逆转录引物序列（CaHc1, Caκc1, Caλc1），RNA模板量（2 μg），反应温度和时间（37°C 60分钟） 阅读提示：STAR Methods, cDNA synthesis from total RNA |
| 5'RACE PCR | 5'RACE引物序列，使用的试剂盒（SMARTer RACE），PCR循环条件 阅读提示：STAR Methods, 5'RACE amplification |
| 持留文库构建 | 限制性酶切位点（NcoI、AscI、MluI、NotI），连接条件（16°C过夜），电穿孔参数（1.8 kV, 200 Ω, 25 μF） 阅读提示：STAR Methods, Construction of heavy chain and light chain holding libraries |
| scFv文库构建 | 连接策略（一锅法），载体和插入片段摩尔比（约1:10），电穿孔后细胞培养条件 阅读提示：STAR Methods, Cloning of heavy and light chains into a single chain library |
| 生物淘选 | 抗原包被浓度（EGFP/mCHERRY 15 μg/mL，PD-1 200 ng），洗脱方法（高pH三乙胺或胰蛋白酶），筛选轮数（6轮或4轮） 阅读提示：STAR Methods, EGFP and mCHERRY biopanning procedures |
| IgG表达 | ExpiCHO-S细胞培养条件（250 mL，37°C，8% CO2），转染试剂和方法，收获时间（第10和12天） 阅读提示：STAR Methods, Production of IgG in CHO cells |
| 表位作图 | 使用的肽库（Ph.D.-12），生物素化肽合成，ELISA条件 阅读提示：STAR Methods, ELISA and pepscan to localize the epitope |