纳米抗体生成与筛选
利用羊驼免疫和噬菌体展示获得H7特异性纳米抗体。
用灭活H7N9病毒免疫羊驼，构建噬菌体展示文库，以H7-HA为靶标进行三轮淘选，筛选出六种独特纳米抗体并表达Fc融合蛋白。
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甲型流感病毒H7纳米抗体识别血凝素头部保守免疫优势表位并赋予异亚型保护
Influenza A Virus H7 nanobody recognizes a conserved immunodominant epitope on hemagglutinin head and confers heterosubtypic protection.
实验完整度
高包含体外中和、结合、表位作图（逃逸突变、噬菌体展示、建模）、体内预防/治疗保护（三种亚型）、B细胞免疫优势分析及肽免疫保护等多个独立证据层级。
主要模型
A549细胞（人肺癌细胞系） MDCK细胞（犬肾细胞系） C57BL/6小鼠 SPF鸡胚
重点核对
E10纳米抗体序列和CDR3特征（17个氨基酸，含YCSFR序列） E10靶向表位K166和S167（H3编号）在H7 HA中的保守性 E10体内保护实验的给药剂量：预防10 mg/kg（i.p.），治疗25 mg/kg（i.p.） H7N9攻毒剂量：106 EID50；H3N2:107 TCID50；H1N1:3×103 TCID50 逃逸突变病毒（K166T, S167L）的制备和验证
摘要
流感仍然是一个持续的全球健康挑战，主要原因是病毒持续的抗原漂移和偶尔的抗原转变，这阻碍了通用疫苗的开发。为解决这一问题，识别广泛中和抗体及其表位至关重要。纳米抗体凭借其独特的特性和结合能力，为识别此类表位提供了有前景的途径。在此，我们分离并纯化了一种血凝素（HA）特异性纳米抗体，其可识别甲型流感病毒的H7亚型。该纳米抗体名为E10，表现出广谱结合、跨组中和以及针对多种甲型流感亚型的体内保护作用。通过噬菌体展示和体外表征，我们证明E10特异性靶向HA头部的一个表位，该表位是保守侧翼斑块的一部分，并且在H7感染时具有高度免疫优势。重要的是，用包含E10表位的肽免疫可引发交叉反应性抗体，并介导对致死性病毒攻击的部分保护。我们的数据强调了E10及其相关表位作为未来流感预防策略候选者的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在鉴定一种能够识别甲型流感病毒H7亚型HA上保守表位的广谱中和纳米抗体，并探究该表位的免疫优势性及其作为疫苗靶点的潜力。
- 核心机制
- E10纳米抗体通过结合HA头部侧翼斑块上的保守表位（包含K166和S167残基），阻断病毒附着和早期进入，从而发挥中和作用；该表位在H7感染中具有免疫优势，但突变株（K166T, S167L）逃逸E10识别且病毒适应性降低。
- 主要证据
- 通过免疫羊驼和噬菌体展示分离E10；ELISA和中和实验证明其广谱结合和交叉中和；逃逸突变、噬菌体展示和建模定位表位；小鼠体内实验证明预防和治疗效果；B细胞和抗体分析显示表位免疫优势；肽免疫提供部分保护。
- 研究意义
- E10纳米抗体及其表位为流感治疗和通用疫苗设计提供了候选工具和蓝图，尤其针对具有大流行潜力的禽流感病毒（如H7N9）。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能表征
评估纳米抗体的结合、中和及血凝抑制能力。
通过免疫荧光、Western blot、中和试验和血凝抑制试验检测六种纳米抗体对H7N9的识别和中和效果。
广谱性评估
测试E10对其他亚型（H1、H3）的结合和中和能力。
ELISA检测E10与不同HA蛋白和灭活病毒的结合，中和试验评估对H1N1和H3N2的中和效果。
病毒感染周期阶段阻断分析
确定E10作用于病毒感染的哪个阶段。
在不同时间点（早期进入、内化、复制、释放）加入E10，通过qPCR检测HA基因表达水平。
体内保护实验
评估E10在小鼠模型中预防和治疗H7N9、H1N1、H3N2感染的效果。
小鼠腹腔注射E10（预防10 mg/kg，治疗25 mg/kg），感染病毒后监测体重和生存率，检测器官病毒滴度和肺病理。
表位鉴定
确定E10在HA上的结合位点。
利用逃逸突变（鸡胚和细胞培养）、噬菌体展示肽库和分子建模（ClusPro）定位E10的表位。
验证逃逸突变的影响
确认K166T和S167L突变是E10结合关键，并评估突变株的适应性。
通过IFA、WB、ELISA、中和试验验证E10对突变株失效；比较WT和突变株的生长动力学和体内致病性。
免疫优势性分析
确定E10表位在H7感染中的免疫优势性。
感染WT或MUT病毒的小鼠，14天后取肺、淋巴结、脾脏，流式检测GC和MBC细胞对表位的特异性；ELISPOT检测ASC；ELISA检测血清抗体。
肽免疫保护实验
测试包含E10表位的肽疫苗能否提供交叉反应性抗体和保护。
用H7HA166-186肽（与OVA偶联）免疫小鼠，检测血清结合和HI活性，并进行致死攻毒。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10,270–106 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15,140,163 | |
| Kaighn改良Ham's F12培养基 | Gibco | C11330500BT | |
| Freestyle 293表达培养基 | Gibco | 12338018 | |
| 纳米抗体生产 | ExpiFectamine™ 293转染试剂盒 | Gibco | A14525 |
| 免疫荧光 | 抗人IgG（Fc特异性）-488 | Invitrogen | A55747 |
| DAPI染色液 | Beyotime | C1002 | |
| 西方印迹 | 硝酸纤维素膜 | Cytiva | 1060000 |
| 抗GAPDH抗体 | -- | ab181602 | |
| 抗NP抗体 | Sino Biological | 11675-V08B | |
| 小鼠抗人IgG Fc抗体 | GenScript | 50B4A9 | |
| SuperSignal West Dura延长底物 | Thermo Fisher | 34076 | |
| ELISA | TMB底物 | Thermo Fisher | 34029 |
| 抗小鼠Igκ抗体 | Sino Biological | 68077-R008-H | |
| 小鼠抗人IgG Fc抗体 | Sino Biological | SSA001 | |
| TECAN Sunrise吸光酶标仪 | -- | 16039400 | |
| RNA提取和qPCR | TRIzol试剂 | -- | -- |
| M-MLV逆转录酶 | Promega | M1701 | |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD3 BV510抗体 | BD | 563024 |
| 抗小鼠IgM PE/Dazzle 594抗体 | BioLegend | 314529 | |
| 抗小鼠IgD BV785抗体 | BD | 563618 | |
| 抗小鼠CD38 FITC抗体 | BioLegend | 102705 | |
| 抗小鼠GL7 PE抗体 | BioLegend | 144607 | |
| 抗小鼠B220 Pe-Cy7抗体 | BioLegend | 103221 | |
| 链霉亲和素-APC | BioLegend | 405243 | |
| Brilliant Violet 421链霉亲和素 | BioLegend | 405225 | |
| Brilliant Violet 650链霉亲和素 | BD | 563855 | |
| PerCP5.5链霉亲和素 | BioLegend | 405214 | |
| Live/Dead Aqua染色试剂 | Invitrogen | L34966 | |
| ELISpot | 抗小鼠IgG H+L HRP | Aviva Systems Biology | ORA 04973 |
| BD ELISpot AEC底物 | BD | -- | |
| 病毒培养 | TPCK处理的胰蛋白酶 | -- | -- |
| 完全弗氏佐剂 | Thermo | 77140 | |
| 不完全弗氏佐剂 | Thermo | 77145 | |
| EcoRI-HF限制酶 | NEB | R3101S | |
| XhoI限制酶 | NEB | R0146S | |
| In-Fusion克隆试剂盒 | Takara Bio | 638948 | |
| 肽免疫 | AddaS03™佐剂 | InvivoGen | vac-as03-10 |
| H7HA166-186肽 | GenScript | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 纳米抗体生成 | 羊驼免疫方案（抗原剂量、佐剂、次数、间隔）；肽库文库构建方法（引物、载体）；淘选条件（靶标浓度、洗脱方式） 阅读提示：Methods：Alpaca immunization and phage display selection |
| 体外功能验证 | 细胞系（A549、MDCK）及其培养条件；病毒感染复数（MOI）和处理时间；中和试验中病毒和纳米抗体孵育时间及温度；血凝抑制试验中病毒单位（HAU） 阅读提示：Methods：Neutralization assay, Hemagglutination inhibition assay, Figure legends of Fig.1 |
| 体内保护实验 | 小鼠品系、年龄、性别；给药剂量和途径（预防10 mg/kg i.p.，治疗25 mg/kg i.p.）；攻毒剂量和途径（H7N9 106 EID50 i.n.等）；体重监测标准（25%体重减少作为终点） 阅读提示：Methods: Prophylactic and therapeutic nanobody administration in mice |
| 表位鉴定 | 逃逸突变选择的宿主（SPF鸡胚或MDCK细胞）；纳米抗体浓度范围；选择轮数；测序方法（NGS） 阅读提示：Methods: Escape mutation selection, Next-generation sequencing (NGS) analysis |
| 免疫优势性分析 | 感染剂量（WT 0.1 TCID50, MUT 50 TCID50）；B细胞门控策略；HA蛋白标记方法（荧光素和链霉亲和素比例）；ELISPOT实验中细胞数量 阅读提示：Methods: Virus infection of mice and flow cytometry analysis, B cell ELISpot assay |
| 肽免疫 | 肽序列（KSYKNTRKSPAIIVWGIHHSV）；偶联OVA；免疫剂量（100 μg）和佐剂（AddaS03）；免疫时间表（三次，第三次无佐剂）；攻毒时间和剂量（H7N1 1 TCID50） 阅读提示：Methods: Peptide preparation and immunization |